通过醋酸诱导大鼠肛肠黏膜损伤建立痔病模型的效果评价*

吴琳琳，刘朝阳，田茂生，张明全，赵娜，高记华

1 河北中医学院 河北石家庄 050091

2 河北中医学院第一附属医院肛肠科 河北石家庄 050011

痔是人类特有的一种肛肠疾病，常有“十人九痔、十女十痔”等说法，近年来，随着人们饮食习惯、生活习惯、人口老龄化等的改变，痔病愈发成为人们的常见病、多发病，其在急性发作期间可出现大量出血、嵌顿、疼痛等症状，严重影响人们的健康和生活质量[1-2]。关于痔的病因及发病机制先后有肛垫下移学说[3]、静脉曲张学说[4]、血管增生学说[5]等，但尚未取得一致结论。目前多认为痔组织主要由受损后异常扩张的静脉血管组成，静脉内常见血栓形成，此外还常伴有炎性改变（如淋巴细胞、中性粒细胞、浆细胞等炎性细胞浸润）、水肿和充血等，造成肛肠黏膜损伤，表面可见溃疡形成[6-7]。一项关于痔组织病理分析的研究结果显示，痔组织主要的病理改变有：炎性细胞浸润、增生性病变、血栓形成和黏膜水肿、糜烂、溃疡等[8]。目前，临床对轻度痔病一般多采用保守疗法，对于已发展为Ⅲ度、Ⅳ度的痔病，多采取手术治疗[9]。

目前，国内外尚没有成熟的痔肛肠黏膜损伤动物模型，探索建立痔模型的相关方法主要有将化学刺激物、致炎剂、抗凝血药物等注射或涂于肛内外、肛周，导致局部发生感染和炎性反应；或采用手术结扎直肠、会阴部静脉造成黏膜缺血坏死等[10-11]。要进一步研究痔病因及发生机制，制作出与人类痔病病理变化相近的动物模型是关键的一步。本研究采用醋酸造模，主要是通过醋酸的化学刺激造成肛肠黏膜屏障结构破坏，通过激活环氧合酶和脂氧合酶途径启动炎性反应[12]，进一步形成肛肠黏膜的损伤。本研究旨在通过创新优化痔肛肠黏膜损伤模型的建立，提高动物模型与人类痔病理特点的契合度，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

试剂：10%醋酸溶液（取醋酸液5 mL与注射用水45 mL混合均匀）、2%异氟烷（批号：2017171101，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）、75%酒精（批号：191014，无锡华澳药业有限责任公司）、注射用水。

仪器：多通道动物麻醉系统（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）、FA-N型电子天平（上海力辰邦西仪器科技有限公司）、Leica ASP300S型全自动脱水机（德国LEICA公司）、Leica RM2245型半自动切片机（德国LEICA公司）、Leica TS5015型全自动染色机（德国LEICA公司）、Olympus BX45型光学显微镜（日本Olympus公司）、DP72型图像分析系统（日本Olympus公司）、HH-1型数显恒温水浴锅（常州智博瑞仪器制造有限公司）、D610型数码相机（尼康映像仪器销售有限公司）。外科手术器械、1 mL注射器、2 mL注射器、滤纸、棉签、比例尺。

1.2 实验动物

SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，6～8周龄，重量（200±20）g，由浙江维通利华实验动物技术有限公司提供，使用许可证：SYXK（苏）2016-0042。大鼠在环境温度为（22±2）℃，湿度40%～70%，昼夜12 h/12 h明暗循环的标准动物房内适应性饲养1周，正常饮食并观察正常生长活动和健康状况。实验前禁食不禁水12 h。

1.3 实验方法

1.3.1 分组与造模 选取SPF级SD大鼠40只，按重量随机分为4组，分别标记为空白对照组、D3组、D7组、单次造模组，每组各10只，各组具体造模方法和步骤如下：用2%异氟烷使大鼠吸入麻醉，取仰卧位，挤出直肠末端粪便；用75%酒精棉球消毒肛门外周皮肤；将棉签在10%醋酸溶液中浸泡至少3 s达到饱和状态，取出后在滤纸上吸附掉棉签过饱和的溶液，插入大鼠肛门内0.5 cm，保持10 s，棉签取出后在肛周均匀涂抹一圈。各组内每只大鼠操作方法相同，单次造模组只操作1次；D3组、D7组每天操作一次，连续3天；空白对照组给予浸泡注射用水的棉签处理，连续操作3天。

1.3.2 标本制备 造模第3天操作后6 h，D3组、单次造模组动物采取颈椎脱臼法处死，剩余两组大鼠暂不做处理。造模第7天，处死D7组和空白对照组大鼠。大鼠处死后沿肛周皮毛边缘约0.3 cm处环形分离肛门，深至直肠1.0 cm以上，剪断肠管移出标本。由同一人剪取肛肠组织0.8 cm，纵剖肠管，平铺肠管后拍照。

1.4 观察指标

（1）取材后对直肠进行大体形态观察，观察黏膜有无出血、水肿、溃疡。

（2）拍照后，称量湿重，测量肛肠系数：肛肠系数（%）=肛肠湿重/动物体重×100%。

（3）病理形态观察：称重后，肠管平铺在纸板上，大头针固定样本四角，保持肠管平整，黏膜面朝向固定液，样本固定48 h后送检。常规苏木精-伊红染色，观察肛肠组织的病理学改变。参照文献评分标准[13]并结合结肠组织病理学评分（HS）标准评定为轻微、轻度、中度、重度，分别记为1～4分，无病变标记为0分，缺失记“无”，损伤性改变包括上皮坏死、脱落、缺失，充血，水肿，炎性细胞浸润；分值越高，损伤越重。①上皮细胞：有杯状细胞丢失记1分；杯状细胞大面积丢失记2分；隐窝细胞丢失记3分；隐窝细胞大面积丢失记4分。②充血：未见明显充血记1分；可见明显充血记2分；严重充血记3分。③水肿：轻度水肿记1分；中度水肿记2分；重度水肿记3分。④炎性细胞浸润：浸润在隐窝基底层记1分；浸润达黏膜肌层记2分；浸润深达黏膜肌层，伴黏膜增厚、腺体破坏记3分；浸润深达黏膜下层，结构明显破坏记4分。个体评分用各评分标准记分总和表示，各组组织损伤程度用所有个体评分的均值表示。

1.5 统计学方法

采用Excel 2013录入数据，SPSS 22.0对数据进行统计分析。正态分布的计量资料以（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两组间比较采用LSD-t检验，两组间比较采用t检验。偏态分布的计量资料以M（QL，QU）表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 大鼠肛肠黏膜大体观

空白对照组大鼠直肠形态正常，未发现黏膜出血、水肿和溃疡；D3组大鼠直肠黏膜溃疡、损伤明显，可见出血水肿，轻微挤压可见透明状渗出物；D7组大鼠直肠黏膜损伤情况较D3组有所改善，局部充血、水肿减轻，溃疡面积减小、颜色变浅。单次造模组大鼠可见部分直肠黏膜损伤，甚至充血，但损伤较浅且同一水平黏膜比较，损伤程度不一，提示造模效果未达到均匀。因此，从大体形态观察角度，可以认为D3、D7组造模效果优于单次造模组，且D3组正处于损伤高峰期，与痔病急性期表现有高度相似性。见图1。

图1 大鼠直肠黏膜大体观

2.2 大鼠肛肠系数比较

三组间肛肠系数比较差异有统计学意义（P＜0.05），两两比较结果显示，空白对照组与D3组之间差异有统计学意义（P＜0.05)，而D7组与空白对照组、D3组比较差异均无统计学意义（均P˃0.05），见表1。从肛肠系数角度分析，D3组造模效果优于D7组。单次造模组肛肠系数为0.0760（0.0658，0.0799），呈偏态分布，且该组肛肠黏膜大体观损伤面积、程度不均匀，结合以上两点依据可认为该组造模不成功，故未与其他各组数据进行比较。

表1 大鼠肛肠系数比较

2.3 大鼠肛肠黏膜病理情况

空白对照组肛肠黏膜未见明显异常，各观察项目均记为0分。单次造模组大鼠由于造模不成功未做病理切片。D3、D7组大鼠肛肠黏膜组织病理学评分比较差异均无统计学意义（均P˃0.05）。与空白对照组比较，光镜下可见D3组大鼠肛肠黏膜部分上皮细胞坏死脱落，间质疏松水肿伴有大量中性粒细胞、浆细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，黏膜层可见充血，血管扩张多以小静脉为主。D7组大鼠肛肠黏膜充血、水肿症状较前减轻，但仍存在炎性细胞浸润表现。3组大鼠肛肠黏膜病理结果见图2。大鼠肛肠黏膜病理结果与大体观、肛肠系数结果总体相符。D3、D7组大鼠肛肠组织病理学损伤评分见表2。

图2 大鼠肛肠组织病理形态（苏木精-伊红染色，×10）

表2 D3、D7组大鼠肛肠组织病理学损伤评分比较 分，±s

表2 D3、D7组大鼠肛肠组织病理学损伤评分比较 分，±s

组别D3组（n=10）D7组（n=10）上皮脱落/坏死/缺失2.30±0.82 1.90±0.87充血/出血1.50±0.70 0.80±0.70水肿0.50±0.42 0.60±0.51炎性细胞浸润2.20±0.63 1.90±0.73总分6.50±2.37 5.20±2.34 tP 1.233 0.234

3 讨论

痔病临床症状多表现为坠胀、便血、疼痛等，这与病变黏膜炎性水肿、血管损伤密切相关[14]，肛肠系数可准确反映病灶局部的变化，可作为痔病模型的定量评估参数。本实验中D3、D7组大鼠肛肠黏膜局部血管通透性改变、组织间质水肿渗出明显，导致组织体积密度变化，单位组织的重量不同程度增加。单次造模组大鼠肛肠系数虽有一定程度增加，其肛肠黏膜大体观水肿程度不明显，黏膜损伤较轻，不完全符合病灶表现。病理组织学观察发现，与空白对照组相比，D3、D7组可见部分上皮组织缺损，黏膜层充血、水肿及炎性细胞浸润等病理改变，与人类痔病患者肛肠黏膜组织发生的病理改变相似。造模后随着时间延长，大鼠肛肠黏膜水肿及炎性细胞浸润程度轻微减轻，余病理变化仍然存在，但是两组病理损伤积分相比差异无统计学意义，可以认为该模型稳定性高。痔局部病理指标可以准确判定病变的轻重程度，是痔病模型效果评价的直接相关指标[11]。因此，结合痔病模型制备规范及本次模型制备实验结果，可认为大鼠肛肠黏膜大体形态、肛肠系数和病理表现等是判断痔病模型制备是否成功的重要指标。

本研究创新点在于规范标准化操作流程，采用多次局部诱导方法，使模型达到均一、稳定的效果。醋酸是一种化学试剂，在常温下是一种具有强烈刺激性酸味的无色液体，可以使组织水肿、产生溃疡[15-16]。黎小平等[17]曾以4%醋酸棉签经大鼠肛门置入直肠时间为1 min、深度为3 cm的方式造模使大鼠直肠黏膜损伤，形成类似痔的病理变化；程雷等[18]采用1%的醋酸溶液3 mL经肛门灌注大鼠结直肠腔，结果发现黏膜和黏膜下层损伤最严重程度见于第1～3天。本研究利用醋酸这一特性，通过局部应用诱导，使动物肛肠黏膜发生水肿、溃疡，从而模仿临床痔病急性发作期的症状及病理改变。为了仅形成大鼠肛肠黏膜损伤，本实验采用棉签蘸取10%醋酸局部造模。通过本次实验对比发现，单次造模组多出现黏膜损伤较轻或者不均匀现象，而多次诱导的D3、D7组模型均一稳定。醋酸属水溶剂，采用棉签造模时因为重力因素，黏膜后壁损伤大于两侧壁及前壁，易影响造模稳定性。本实验表明采用3次造模方式及规范化操作可以更好地控制模型病灶，得到均一度、稳定性、重复性更好的动物模型，且模型病变范围、病变程度更匹配人类痔病患者的病理生理学特点，较好地模拟人类痔病的病理过程，使动物模型更贴近临床。

综上所述，本方法可以建立起接近人类痔病病理损伤表现且稳定可靠的大鼠肛肠黏膜损伤模型，且操作简单、成功率高、稳定性好，可作为研究痔病各种治疗方法的重要基础。