三唑类杀菌剂农药残留分析技术的发展现状

桑楠，周萌萌，库婷婷

（山西大学 环境与资源学院，山西 太原 030006）

0 引言

农药是农业生产过程中非常重要的化学药品。农药是否合理使用、残留是否超标以及施用的安全性等问题一直都是科研人员关注的重点。尽管近几年来我国农药的使用量开始呈现了负增长的趋势，但就数量来说，使用量依然巨大，年使用量居世界首位[1]。三唑类杀菌剂作为全球杀菌剂类别中品种最多的一个大类，是近几年来最常用的农药之一，自20世纪70年代开始进入农药市场，随后戊唑醇、烯唑醇、腈菌唑、苯醚甲环唑、丙环唑等众多三唑类杀菌剂也都陆续应用于农业生产中[2]。三唑类杀菌剂具有高效、低毒、持效期长、内吸性强等特点[3]，它能够有效抑制甾醇生产中的一种特定酶类C14-脱甲基酶的活性，影响功能性细胞壁的发育从而导致子囊菌、半知菌、担子菌等真菌异常生长并最终死亡，可用于防治白粉病、锈病和叶斑病，在防病治病、调节植物生长方面显示出巨大的潜力[4]。此外，三唑类杀菌剂具有抗孢子的特性，可用于预防或作为真菌早期感染治疗的主要药剂[5]。

三唑类杀菌剂因其高度的化学稳定性，半衰期长、不易生物降解、易于在环境中运输等特点，使得它在各种环境介质中被广泛地检测出来[6]。戊唑醇、苯醚甲环唑、丙环唑及三唑酮等三唑类杀菌剂在葡萄、苹果、石榴等水果中被广泛检出，其中戊唑醇在葡萄中的半衰期最长可达9.8 d～12.2 d，残留量为0.002 mg/kg～0.298 mg/kg，相较于水果，三唑类杀菌剂在农作物中的半衰期较短，但在稻田土壤中的时间却可长达23 d之久[7-11]。可见三唑类杀菌剂在多种环境介质中能够长期残留，可能对动物以及人体都存在很大的危害。

现有研究证实，三唑类杀菌剂能够引起胚胎发育毒性并危及肝脏、肾脏、肠道等多种代谢器官。不同浓度的环丙唑醇（1 mg/L和10 mg/L）可诱导黑斑蛙蝌蚪的体重下降、变态发育缓慢和行为终点异常[12]。丙环唑可以显著抑制斑马鱼胚胎和幼虫的发育，造成脂蛋白脂肪酶和脂肪酸合成酶活性显著降低及脂质代谢相关基因表达水平明显上调，对水生生态系统构成潜在健康风险[13]。此外，在关于腈菌唑对映选择性毒代动力学和毒性积累的研究中发现[14]，在肝脏、脂肪、皮肤、肠道、肺和肾等组织器官中观察到腈菌唑富集，并在肝脏中观察到肝细胞肥大，核固缩，空泡化和非带状大泡脂质积聚等组织病理学变化。在氟环唑对Wistar大鼠肝脏和肾脏的毒性作用研究中，也发现了肝脏和肾脏组织的整体组织严重损害及肝脏和肾脏功能的显著失调[15]。可见三唑类杀菌剂对多种生物体构成的潜在健康风险不容忽视，发展更为先进、有效、灵敏的农残检测技术就显得尤为重要。

1 三唑类杀菌剂样品预处理

样品提取过程是在样品中提取待测物，通过一系列步骤进行净化，除去与其共存的杂质，从而降低背景干扰以及减少杂质对检测器和色谱柱影响的过程。样品提取是检测痕量农药的基础，也是分析残留水平的核心步骤。由于基质的复杂性，在农药提取过程中需要优化各种因素[16]。样品的前处理技术一般包括样品制备、提取、纯化等操作过程。目前，固相萃取、固相微萃取等一系列前处理技术因其应用范围广、使用简便高效的特点被广泛应用于科学研究和实际样品检测。

1.1 固相萃取（Solid Phase Extraction,SPE）

固相萃取（SPE）是样品制备技术。其作用原理是待测物在溶剂中的溶解能力低于固定相对其的吸附力，因此在样品通过时，目标化合物被固定相所固定，而杂质则溶解在溶液中，以此达到净化提纯的目的。SPE技术的核心是固相萃取柱，通常需要用到乙腈、甲苯、丙酮、正己烷等有机溶剂以合适的比例对其进行淋洗预处理。SPE技术比液/液萃取更有效，可进行定量萃取，易于执行，快速并且可实现自动化，减少了溶剂的使用和实验时间。SPE最常用于制备液体样品并提取半挥发性或非挥发性分析物，但也可以与预先提取到的溶剂中的固体一起使用，非常适合样品提取，浓缩和净化，可用于多种化学成分、吸附剂和尺寸。

陶凌云[17]采用 Carbori/NH2提取样品，检测水果蔬菜中13种三唑类农药的残留水平，实验回收率达到90%～103%，相对标准偏差（RSD）为1.5%～6.5%。Hansen等[18]使用固相萃取法对水样中的戊唑醇进行定量，将SPE柱用甲醇和超纯水预处理，用乙腈将分析物从SPE中洗脱到试管中，绝对回收率79.6%～87.8%，该方法可以在浓度低至3.89 pg/mL的10 mL水样中检测戊唑醇。

1.2 固相微萃取（Solid Phase Microextraction,SPME）

目前固相微萃取技术应用最活跃的领域是环境、食品和临床。Silva等[19]使用了SPME纤维涂层聚二甲基硅氧烷（PDMS），SPME法允许在复杂食品基质中直接浸泡萃取。Munitz等[20]使用与气相色谱相结合的SPME开发了同时测定蓝莓中丙环唑异构体和戊唑醇残留物的分析方法，选择的SPME纤维涂层是碳氧二乙烯基苯（CWX-DVB），所有化合物的回收率为97.4%～98.9%，丙环唑I的检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.21 μg/kg和0.49 μg/kg，丙环唑II的LOD和LOQ分别为 0.16 μg/kg和0.22 μg/kg，戊唑醇的LOD和LOQ分别为和0.16 μg/kg 和 0.48 μg/kg。Zhang 等[21]制备锌基金属-有机骨架-5和氧化石墨烯（金属-有机骨架-5/氧化石墨烯）的混合材料作为用于SPME的新型纤维涂层材料，RSD为3.7%～8.5%，回收率在85.6%～105.8%范围内。该方法简单易操作，富集力强，但灵敏度及稳健性有待提高。

1.3 加速溶剂萃取（Accelerated Solvent Extraction,ASE）

1995年，Richter等提出了ASE技术，该方法是在一定压力（10.3 MPa～20.6 MPa）和较高温度（20℃～200℃）条件下，用有机溶剂萃取，适用于固体和半固体样品，已成为各种环境基质中有机物提取的重要手段[22]。加速溶剂萃取法样品处理简单，萃取可以自动化，并且所有步骤可以保证一致，萃取时间短，溶剂用量少，但是使用该方法后仪器需要清洗且费时，维护仪器的成本较高，萃取选择性较差。Mir等[23]利用ASE法测定蜂蜜中戊菌唑、己唑醇、烯唑醇、戊唑醇和苯醚甲环唑这五种典型三唑类杀菌剂的残留水平，提取回收率为97%～100%。在每种分析物的1.5 ng/g下评估方法精密度，发现相对标准偏差在日内小于4%，在日间小于6%。吴慧珍[24]采用选择性加速溶剂萃取法测定杭白菊中19种三唑类杀菌剂。19种三唑类杀菌剂方法LOD及LOQ分别为0.6 μg/kg～ 3.0 μg/kg和2.1 μg/kg ～ 10.0 μg/kg。在10 、50 、100 μg/kg加标水平下，目标物的回收率为70.3%～95.3%，RSD为0.60%～12%。

1.4 基质固相分散萃取（Matrix Solid Phase Dispersion Extraction,MSPD）

MSPD应用范围宽，操作简便，有机溶剂用量较少，成本低，不需要特殊的仪器设备[25]。张娟等[26]测定大米中毒死蜱、三环唑和戊唑醇的残留水平，得到三环唑的加标回收率为85.3%～92.6%，戊唑醇的加标回收率为82.4%～96.3%，证明了基质固相分散萃取法回收率高并且高效，RSD均小于10%。Xue等[27]开发了涡旋辅助基质固相分散微萃取（VA-MSLDME）的一步法分析法，测定了棉籽和金银花中的7种三唑类杀菌剂。在基质/乙腈/水/甲苯体系中同时提取，净化和预浓缩样品中的目标杀菌剂。样品中杀菌剂的回收率为82.9%～97.8%，RSD为4.4%～8.5%。该方法最重要的创新是在单一系统中同时混合基质和净化吸附剂（作为两个固相），萃取/分散溶剂，水和微萃取溶剂（作为三个液相），能够在6 min内一步完成同步提取/净化/预浓缩，无须获得额外形式的能量（例如超声波，磁力搅拌，高压或高温）。Aladaghlo等[28]建立了超声辅助-分散固相萃取法，对痕量的三唑类杀菌剂进行检测，由负载在离子液体改性的氧化石墨烯上的N-杂环卡宾铜络合物制备吸附剂。加标回收率为92%～94%。

1.5 凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography,GPC）

GPC不仅可以分离小分子化合物，还可以分析同系物[29]。目前，凝胶渗透色谱多应用于粮食，动物源农产品，而水果蔬菜方面的应用还不是很多[30]。贾楠[31]使用凝胶渗透色谱仪净化来自农产品的待测样品，其中共包含18种三唑类杀菌剂，实验测得回收率为80%～120%，RSD＜16%，LOD为0.06 μg/kg ～ 62 μg/kg。Yao等人[32]运用凝胶渗透色谱和HPLC-MS技术，建立了一种新型、高效地对映选择性测定食用植物油中三唑酮及三唑醇的方法。总体平均回收率为90.1%～97.3%，RSD为0.8%，所有对映体的LOQ为0.5 μg/kg。

1.6 微波辅助萃取（Microwave Assisted Extraction,MAE）

MAE是利用微波加热与样品接触的溶剂将分析物从样品基体中分离到溶剂中的过程，是一种自动化的绿色萃取技术。MAE很大程度上符合现代样品制备技术所需的最低标准，并且为从多种基质中萃取有机和有机金属化合物的常规方法提供了非常有吸引力的替代方法[33]。Wang等[34]采用微波辅助萃取测定环境水样中的腈菌唑、戊唑醇、苯醚甲环唑的残留水平。该方法中微波辐射用于破乳，以低密度甲苯作为萃取剂，成功地实现水样中三唑类杀菌剂的相分离和富集。回收率89.3%～108.7%，RSD为5.4%～8.6%。高效且回收率高。Bagheri等[35]采用微波辅助萃取来促进农药残留物从苹果基质转移到液体介质中，LOQ低于120 μg/kg，低于最大残留限量。RSD为2.24%～7.79%。

固相萃取等三唑类杀菌剂样品预处理技术各具特点，表1针对其优缺点及主要应用领域进行了总结比较。结合不同的实验条件或检测对象，它们将可以服务于不同类型的三唑类实际样品检测。

表1 三唑类杀菌剂不同预处理技术的比较Table 1 Comparison among different pretreatment technologies for triazole fungicides

2 三唑类杀菌剂样品分析测定

2.1 气相色谱法

气相色谱法中可以使用的检测器有很多种，对于三唑类杀菌剂残留的检测来说，最常用的有火焰电离检测器与热导检测器。国内外关于三唑类杀菌剂残留检测的报道中多采用气相色谱仪（GC）与火焰电离探测器、电子捕获检测器（ECD）、火焰光度检测器（FID）等联用的方法进行残留检测。

余颖[36]使用GC检测水产品中四种三唑类杀菌剂的农药残留，外标法定量，测得平均回收率为78.8%～95.0%，RSD为1.48%～1.4%；四种杀菌剂 LOD 均为 4.0 μg/kg，最低 LOQ 均为 8.0 μg/kg。Xue等[37]采用GC-ECD测定棉籽和金银花中7种三唑类杀菌剂。测得提取回收率为82.9%～97.8%，RSD为4.4%～8.5%。分析物的富集因子范围为22 ～ 47，LOD为0.05 μg/kg～20 μg/kg。证明了ECD对于植物中的三唑类杀菌剂农残检测的效果很好。Mir等[23]使用GC-FID分析水样中五种三唑类农药的残留动态。5种目标农药的LOD为0.20 ng/mL～1.1 ng/mL，RSD在3%～5%之间，富集因子为449～504，回收率为92%～104%。

2.2 液相色谱法

液相色谱法是一种用于将样品分离成各个部分的技术，是基于样品与流动相和固定相的相互作用而发生的。由于分离混合物时可以使用许多固定/流动相组合，因此根据这些相的物理状态对色谱进行了几种不同的分类。液相色谱是最流行的色谱技术，其特点是液体流动相缓慢地向下过滤通过固定相，使分离出的组分也随之流动[38]。

C18是LC中最常用，应用范围最广的色谱柱。高文慧[39]使用C18对粮谷中的四种三唑类杀菌剂进行LC检测。四种杀菌剂的线性范围在0.3 μg/mL～ 100 μg/mL 之间，检出限为 0.1 μg/mL ～ 0.2 μg/mL；平均回收率为84.2%～98.1%，RSD≤2.7%。赵春娟[40]同样使用 C18色谱柱，以甲醇-水（85∶15，V/V）溶液为流动相，对饲料中的目标农药进行LC检测，测得腈菌唑的LOD为 0.05 μg/mL。Liu等[41]通过LC对环境水样中提取的三唑类杀菌剂进行测定。采集了漳州市九龙江河流、湖泊、井水等三个淡水水域的水样，测得检测限和定量限分别为0.0050 μg/L ～ 0.0078 μg/L 和 0.017 μg/L ～ 0.026 μg/L。

2.3 气相色谱-串联质谱法（GC-MS）

GC-MS是目前检测三唑类杀菌剂残留时最常用的方法之一，是一种可以分离、鉴定和定量复杂化学混合物的技术，已使其成为分析环境材料中数百种相对低分子量化合物的理想选择。为了通过GC-MS进行分析，化合物必须具有足够的挥发性和热稳定性。样品通常以有机溶液的形式进行分析，因此需要对目标材料进行溶剂萃取，并对萃取物进行各种“湿化学”技术处理，然后才能进行GC-MS分析。

现有研究发现[42-44]，使用GC-MS可以测定比如大米、小麦等农作物，各种水果蔬菜以及它们所种植环境中的残留三唑类杀菌剂的含量。频率最高被检测到的有丙环唑、三环唑、三唑醇、戊唑醇、三唑酮、戊菌唑、苯醚甲环唑等。检出限和定量限均基本保持在0.01 mg/kg左右，回收率为70%～120%，所得线性效果都很好，重现性均优于±20%。通过不断优化样品预处理技术，推出了快速、高效、准确地测定环境水样中三唑类杀菌剂的方法。例如Wang等[45]的团队采用固相萃取技术结合GCMS，成功检测了水样中的三唑类杀菌剂，加标回收率为89.3%～108.7%，RSD为5.4%～8.6%。另一研究中使用苯基亚芳基聚合物色谱柱（DB-5MS）对环境水样进行测定，杀菌剂加标回收率及RSD分别为82.5%～112.9%和4.7%～13.5%，也是一种高效可行的测定手段[46]。此外，GC-MS也逐步应用到动物源农产品等内源性物质的检测。Caldas等[47]建立了基于基质固相分散（MSPD）技术的GC-MS检测方法，用于测定鱼肝和蟹肝胰脏中三唑类杀菌剂，简单快速且节约成本。Machado等[48]收集了过去30 d内接触三唑类药物志愿者的尿液，并使用旋涡辅助液-液微萃取-气相色谱-质谱法（VALLMEGC-MS）进行分析，发现该方法具有良好的线性（r＞0.99）、精密度（质控品＜15%，定量下限＜20%）、准确度和稳健性，可用于对个人进行生物监测。

2.4 液相色谱-串联质谱法（LC-MS）

LC-MS技术是一种将液相色谱的物理分离能力与质谱的质量分析能力相结合的分析化学技术。由于超过85%的天然化合物具有极性和热不稳定性，而GC-MS不能处理这些样品，因此LC-MS已成为目前应用最广泛的化学分析技术之一。LC-MS可检测的环境介质非常广泛，在农残检测方面的应用日趋广泛。

在检测水果、蔬菜等方面，LC-MS表现出效率高，通量大等突出优势。Zhao等[49]采用LC-MS检测黄瓜样品中的三唑类杀菌剂，在三种浓度水平（1，2 和 10 μg/L）下获得的回收率范围为82.3% ～117.6%，所有分析物的相对标准偏差小于11.8%。刘军等[50]利用LC-MS检测油菜子中三唑醇残留量。使用C18色谱柱，以m/z 296为定量离子，测得三唑醇的保留时间在11.9 min左右，其回收率为71%～110%，RSD 均小于 10%，LOD 为 1.7×10-9g。Nicaellen等[51]使用LC-MS测定烘焙咖啡中的三唑类杀菌剂残留水平。平均回收率范围为74.3%～99.9%，RSD为0.7%～10.2%。LOD范围为0.02 μg/kg ～ 0.05 μg/kg，LOQ 为 0.10 μg/kg。相比 GCMS，LC-MS在检测动物源产品等内源性物质方面则更为便利。李晓丹等[52]建立了猪肉、猪肝及其脂肪组织中21种三唑类杀菌剂的LC-MS检测方法，回收率为69.5%～109.5%，RSD为0.4%～10.8%。Nie等[53]建立了LC-MS手性分析方法，并将其应用于大鼠血浆和组织中灭菌唑对映体的检测。各对映体在25 ng/mL～2500 ng/mL范围内线性关系良好，准确度、精密度、稳定性均满足生物分析要求，可成功地应用于大鼠体内灭菌唑的毒代动力学的研究。Oerlemans等[54]将羟基戊唑醇作为戊唑醇的主要代谢产物，通过LC-MS测定幼儿尿液中的羟基戊唑醇含量来评估了幼儿农药接触暴露风险，发现羟基戊唑醇在0.05 ng/mL～25 ng/mL范围内的平均回收率为106%，RSD为3%。可见对于生物监测、内源性物质检测等研究来说，LC-MS能够给出更高效、准确的实验结果，为农残检测提供更为精密的数据。

LC-MS与GC-MS是色谱技术在农残检测领域的应用，使得农残检测从最初的定性分析到现在可以精确的定量。LC-MS可以在不衍生分析物的情况下，通过电喷雾电离（ESI），大气压力化学电离（APCI）和光电离等软电离技术实现极性及非挥发物质的高效分离和离子生成[55]。LC-MS能够在0.1 ng/mL到1 ng/mL的浓度范围内对多数分析物进行准确定量，且定量限明显要低于GC-MS[56]，能够特异性的鉴别分析物并满足痕量检测的要求。综合而言，LC-MS分析范围广、灵敏度高、选择性好，是目前测定三唑类杀菌剂的主要分析方法。

3 结论与展望

三唑类杀菌剂在农作物、环境水样、动物源食品，以及人体尿液中被频繁检出，造成潜在的生态风险和健康危害。目前GC-MS及LC-MS均被广泛应用于三唑类杀菌剂的农药残留检测，结合固相萃取等合适的前处理技术，可获得理想的分离检测效果。除LC-MS技术外，近年来新兴起了超高效液相色谱-二级质谱（UPLC-MS/MS）的方法，即在LCMS的基础上，将一级质谱（MS）中打碎的碎片离子重新进行二次检测分析，该方法分析时间短，可以更高效彻底地完成样品的分离检测。然而，随着检测对象变得多元化且更加复杂，对农药残留的前处理技术及检测技术提出了更高的要求。由此提示我们，应加快研发高通量、自动化的痕量检测分析技术，降低人为因素的干扰。目前，三唑类杀菌剂在大气、灰尘等介质中的环境行为、人体中的代谢途径及造成的健康风险尚缺乏系统研究数据，未来有待深入研究。