乙型肝炎表面抗原（HBsAg）酶联免疫吸附试验检测灰区设置的探讨

字立源，黄苏金，陈桂余，杨婧涓,兰晓燕，尹潇, 胡付娟,朱碧姝，杨雪，朱荣华

云南保山市中心血站检验科，云南保山 678000

我国是HBV 的高流行地区约占总传染病总数的1/3，我国的 HBV 人群感染率(HBsAg 阳性率 7.18%)。HBsAg 为HBV 感染的最主要指标，是采供血机构保障血液安全必检项目之一，尽管随着科学技术的发展，检测方法、检测技术均有所提高，减低了因输血传播疾病的风险，但输血传播乙肝病毒（HBV）的风险仍然是血液安全面临的巨大挑战。目前检测HBsAg 的主要方法是酶联免疫吸附试验（ELISA），简便、快速、特异、成本低、且灵敏度较高。特别适用于大批量献血者筛查及健康体检。由于窗口期的世界性难题，该站采用两个厂家酶联免疫吸附试验试剂进行两遍检测，酶免检测无反应性标本，再进行1 遍核酸检测。对弱反应性标本设置灰区，灰区范围为（0.5≤S/CO＜1）。灰区的设置一直是采供血机构检测实验室讨论的热点问题，既要保障血液安全，又不能让无辜的献血者淘汰，避免血液的浪费。该中心血站2016 年1 月—2017年6 月以无偿献血者标本27 214 份为样本，对灰区的设置进行相关分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

该中心血站对无偿献血者标本27 214 份，酶免采用HBsAg 酶联免疫吸附试剂盒A 和B 两个厂家，该实验室两试剂均设有灰区，0.5≤S/CO＜1,双试剂有反应性，则报告有反应性；单试剂有反应性，双孔复查，复查只要其中一孔有反应性，则报告有反应性，两孔均为无反应性，则报告无反应性。报告为反应性标本。所有检验标本均同时进行HBV-DNA 检测，委托第三方血站采用诺华检测系统进行检测。

1.2 试剂

HBsAg 酶联免疫吸附试剂盒A 试剂，HBsAg 酶联免疫吸附试剂盒B 试剂。

1.3 结果判定

S/CO≥1 判定为阳性，0.5≤S/CO<1 判定为可疑（灰区），S/CO<0.5 判定为阴性。HBV-DNA 检测有反应性为补充实验的确证标准。

1.4 仪器

全自动酶免分析系统一体机(Uranus AE150)。EVO-150 全自动加样仪，FAME16/20 全自动酶标仪。

1.5 统计方法

采用SPSS 17.0 统计学软件分析数据。

2 结果

2.1 检测结果

共检测27 214 份血液标本，结果见表1。

表1 ELISA 法检测乙肝表面抗原和核酸检测情况

2.2 两试剂ROC 曲线下面积分析

两试剂ROC 曲线下面积结果见表2。

表2 A、B 试剂在不同临界值下ROC 曲线下面积

2.3 试剂A 和试剂B 敏感性和特异性

临界值 （Cut off）S/CO 为 0.5、0.8、0.9、1.0、1.6 时,越接近左上角的曲线，方法学的敏感性和特异性越好，试剂A 优于试剂B。临界值的确定，最接近左上角的切点值（Cut off）是最佳分界值，敏感性与特异性之和最大。所该实验室临界值（Cut off）S/CO 为 0.9 最佳分界值。

3 讨论

乙型肝炎病毒感染的最直接证据是检测其病原标志HBsAg 。HBsAg 作为必检项目之一,常用ELISA方法,该方法以Cut off 值作为判定阴性或阳性结果的分界线标准，受方法学的限制，出现一些接近临界值结果，通常把这一段结果定为“灰区”，为了防止弱阳性标本漏检，确保输血安全，防止HBV 感染，很多实验设立了“灰区”。血液筛查实验室是否应设置灰区、如何设置灰区还存在一定争议[1]。

核酸检测方法是目前血液筛查已经比较成熟的检测方法，可检出血液中较低水平的HBV 病毒，且对于HBV 病毒的隐匿性感染、 病毒亚型和病毒变异也能检出[2-3]。这样的检测数据,反映ELISA 检测灰区标本和单试剂有反应性标本的绝大部分献血者不是正真的HBV 病毒感染者, 该血站对ELISA 方法检测的“灰区”试验结果报告为“有反应性”，并对有反应性”血液作报废处理，对相应的献血员作永久屏蔽。这种做法对输血安全确实有积极作用，但造成血液资源的浪费[4-5]。

从ROC 曲线下的面积评价试剂敏感性和特异性，临界值在 0.5、0.8、0.9 时，A、B 试剂 ROC 曲线下面积相同，A 试剂面积为0.845,B 试剂面积为0.837，说明该实验室准确性较好。临界值S/CO 为1 时，A、B试剂ROC 曲线下面积有所改变。ROC 曲线能兼顾到被评估方法在所有临界值的灵敏度和特异性，曲线下面积（AUC）就越大，表示该方法的灵敏度和特异度就越高，准确性就越高，诊断价值就越大[6]。该实验室通过比较临界值 S/CO 为 0.5、0.8、0.9、1.0、1.6，5 个临界值ROC 曲线下面积，可知临界值 S/CO 为0.9 时，该实验室检测结果灵敏度和特异度就最高，准确性就最高，诊断价值就最大。

Youden 指数 （Youden 指数=灵敏度+特异度-1）是用来评价检筛试验真实性的指标，试剂A 和试剂B最佳临界值（Cut off）为（S/CO 值）0.9，作为检测结果判定值。该实验室以为（S/CO 值）0.5 作为检测结果判定值，低于最佳临界值（Cut off）为（S/CO 值）0.9。试剂A 和试剂 B 厂商推荐的临界值为（S/CO 值）1.0，高于最佳临界值0.9。通过对该实验室A、B 两试剂的比较，试剂A 在敏感性和特异性方面均优于试剂B，敏感性和特异性是诊断方法学评价的重要指标，二者相互矛盾又相互联系。该实验室采用两种检测试剂，在选择试剂检测策略时，两种试剂最好互补。通过该实验室检测数据的分析研究，该实验室最佳临界值（Cut off）为应设置（S/CO 值）0.9，这样即保障检测结果的准确性，又可减少血液不必要的浪费和防止献血者的流失。虽然全国血站实行核酸检测，但各实验室检测能力参差不齐[7-8]。随着检测技术的提高，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测灰区的设置，进行核酸检测和确证试验后，寻找适合该实验室的最佳临界值。