let-7a1和let-7c在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

李殿明，柳兆飞，宁国兰

肺癌是目前发病率与病死率最高的恶性肿瘤，死亡率高主要是由于绝大部分病人确诊时已属中晚期，5年生存率极低[1]。因此，肺癌的早期诊断和有效的治疗方法是改善预后和提高生存率的关键。近年来，一些研究发现微小RNA(microRNA，miRNA)能调节多种肿瘤的发生、发展及转移等[2]。循环miRNAs可作为肺癌诊断标记物[3]，还可在预测肿瘤治疗反应、疗效评价[4]及预后[5]等方面起到重要作用。

miRNA广泛存在于真核生物中，是一种在进化中高度保守的短链非编码RNA[6]。let-7是人体内第一个被发现的miRNA，包含13个成员：let-7-a-1/2/3，let-7-b，let-7-c，let-7-d，let-7-e，let-7-f-1/2，let-7-g，let-7-i，mir-98和mir-202[7]。let-7家族是目前研究最多的miRNA之一，研究[8-10]发现其在多种肿瘤中表达下调，可能作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生、发展。关于let-7与肿瘤的研究大多集中在let-7a和let-7b上，关于let-7c的研究较少，而且let-7a1和let-7c共同在肺癌中的研究，至今未见报道。

本研究通过检测肺癌组织、癌旁正常组织和良性肺疾病组织中let-7a1和let-7c基因的表达，分析两者与肺癌发生、发展的相关性，探讨其在肺癌发生中可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.2 主要试剂 Trizol试剂 (Invitrogen公司)；RNA保存液[(天根生化科技(北京)有限公司)；DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术公司)]；EB(北京天根生化科技有限公司)；All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR检测试剂盒(广州复能)；let-7a1、let-7c基因引物、U6内参引物(广州复能)；SuperScript Ⅲ反转录试剂盒(ABI-invitrogen)；Sybr qPCR 试剂盒(ABI-invitrogen)。

1.1.3 主要仪器 超净工作台(苏州市净化设备有限公司)；Finnpipette各型移液器(芬兰ABI-invit rogen)；7500型PCR仪(美国 ABI 公司)；AlphaView图像分析软件(美国Alpha公司)；Eppendor 5810R型冷冻高速离心机(德国Eppendorf 公司)；琼脂糖水平电泳槽(美国Bio-Rad公司)；MK200-1型干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司)；XW-80A型漩涡混合器(上海医科大学仪器厂)；VCR76X5型振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.1.4 引物设计 PCR反应所用的下游引物为试剂盒提供的通用引物，上游引物是广州复能基因提供的All-in-OneTMmiRNA qPCR引物；let-7a的上游引物序列号为HmiRQP0002；let-7c的上游引物序列号为HmiRQP0006；U6的上游引物序列号为HmiRQP9001。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取 按说明书进行，用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性，28S/18S≥2，说明RNA完整性良好(见图1)。使用分光光度计测定样品OD值，经紫外分光光度仪分析OD260/OD280，OD260/OD280值均为1.8～2.0。

1.2.2 荧光定量PCR 染料法荧光定量PCR 检测组织中miRNA表达。因成熟let-7很短，只有22 nt，而且其末端不具有mRNA所有的多聚腺苷酸尾巴，所以普通逆转录试剂盒中的随机引物和Olig(dT)引物几乎不能对其进行逆转录。因此，在逆转录前需对其尾端进行加工修饰，本研究选择加尾法修饰进行逆转录，首先利用ploy(A)酶在其尾端进行加尾反应，产物类似mRNA，然后再利用Olig(dT)引物对其进行逆转录，确保荧光定量PCR的特异性。

按All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR检测试剂盒加尾法逆转录和PCR试剂盒说明书步骤进行，PCR仪器程序参数设置如下：预变性95 ℃、10 min，1个循环；变性95 ℃、10 s，退火60 ℃、24 s，延伸72 ℃、34 s，共40个循环。扩增结束后直接做溶解曲线检测 PCR 产物的特异性。以cDNA为模板，U6为内对照，检测各标本的let-7a1和let-7c的相对表达水平。

1.2.3 PCR产物的判定和计算 50×ROX Reference Dye是荧光定量PCR常用的DNA结合染料。因染料法与双链DNA结合并不是一一对应，一旦有引物二聚体形成或非特异性扩增都将影响结果。所以通过溶解曲线分析判断PCR反应的特异性。最终以内参校正的相对值作为后期统计分析数据。

1.6 统计分析 数据由双人录入，建立数据库，采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理，计数资料采用百分比描述，计量资料采用均数±标准差描述，构成比的比较采用卡方检验。

使用ABI公司的StepOnePlusTM(96孔)实时荧光PCR扩增仪进行实时荧光定量PCR反应，检测各八连管中cDNA的Ct值(C代表荧光信号到达阈值时所需要的PCR反应次数，t代表循环阈值)，实验设3个复孔，取平均值，以组织中U6的表达作为内参进行相对定量，采用2-△△Ct值法计算2种miRNA在组织中的相对表达量。公式：△Ct=Ct(let-7)-Ct(U6)，△△Ct=△Ct(实验组织)-△Ct(对照组织)。

1.3 统计学方法 采用t检验、方差分析和q检验。

2 结果

2.1 肺腺癌和鳞癌的病理诊断及免疫组织化学标记结果 肺腺癌病理显示肿瘤结节状生长，浸润周围肺组织；低倍镜下癌细胞呈不规则腺管状排列，在胶原纤维间浸润性生长。免疫组织化学结果显示癌细胞表达TTF1、CK7、NapsionA(见图2)。肺鳞癌病理显示不规则结节状生长，与周围肺组织界限不清；低倍镜下癌细胞呈大小不一的巢团状生长，可见小的角化珠及细胞内角化，间质胶原化。免疫组织化学结果显示瘤细胞表达p63、p40(见图3)。

2.2 let-7a1和 let-7c基因在肺癌组织、癌旁正常组织和良性肺疾病组织中的表达的扩增曲线Line图和溶解曲线图 荧光定量PCR扩增曲线呈较为光滑的S型，均在30个循环以前出现扩增信号，结果较为可靠；由于产物序列不同，溶解曲线荧光信号主峰基本集中在80～90 ℃和78～88 ℃，其前有小的杂峰，考虑为复空中底物浓度过低所至引物二聚体的形成(见图4～7)。

2.3 let-7a1和let-7c基因在肺癌组织、癌旁正常组织和良性肺疾病组织中的表达比较 肺癌组织中let-7a1和let-7c的相对表达量均低于癌旁正常组织和良性肺疾病组织(P<0.05)；癌旁正常组织中let-7a1和let-7c的相对表达量均低于良性肺疾病组织(P<0.05)(见表1)。

表1 肺癌组织、癌旁正常组织和良性肺疾病组织中let-7a1、let-7c基因的表达比较

2.4 let-7a1和let-7c基因在不同病理类型肺癌组织中的表达比较 let-7a和let-7c基因在肺鳞癌和腺癌中的相对表达量差异均无统计学意义(P>0.05)(见表2)；在肺鳞癌和腺癌旁正常组织中的相对表达量差异也均无统计学意义(P>0.05)(见表3)。

2.5 let-7a1和let-7c表达与肺癌临床特征之间的关系分析 let-7a1表达与分化程度、吸烟和TNM分期有关(P<0.05～P<0.01)，与淋巴结有无转移无关(P>0.05)。let-7c表达与淋巴结转移、分化程度有关(P<0.01)，与吸烟、TNM分期无关(P>0.05)(见表4)。

表2 let-7a1和let-7c基因在不同病理类型肺癌组织中的表达比较

表3 let-7a和let-7c基因在不同病理类型肺癌旁正常组织中的表达比较

3 讨论

肺癌是发病率及死亡率最高的癌症，2018年全球肺癌新发病例达到209万余例，肺癌相关死亡病例高达176万余例，同年我国统计数据显示约有77.4万的新增肺癌病例，其中69万人死于肺癌[11]。非小细胞肺癌占肺癌的80%～90%，而小细胞癌在过去20多年里在许多国家的发病率一直在下降[12]。对于非小细胞肺癌，近年来尽管采用了手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等，其5年生存率仅15%[13]。靶向和免疫治疗一直是肺癌领域研究的热点，但也存在较多问题，靶向治疗主要针对有EGFR、ALK、c-MET、ROS1等突变的病人，但仍有大约有一半的非小细胞肺癌病人无明确靶点，同时靶向治疗耐药不可避免；免疫治疗开创肿瘤治疗新纪元，一旦获益可能长期生存，但获益率仅20%左右[14]，且有一定不良反应。因此，进一步阐明肺癌发展演变过程中分子机制，提高靶向和免疫治疗的疗效将对治疗肺癌具有重大意义。

本研究通过荧光定量PCR检测肺癌组织中let-7a1、let-7c的表达情况并结合临床资料，分析其可能的分子机制。结果显示，肺癌组织中let-7a1和let-7c基因表达低于癌旁组织和正常肺组织，差异有统计学意义；但在腺癌、鳞癌组织及其癌旁组织中表达，差异均无统计学意义；这与尚学芹等[15]研究结果一致，也与其在其他肿瘤组织中的表达结果一致[16-17]。但FASSINA等[18]研究认为，在腺癌组织中let-7a、let-7b、let-7c、let-7f、let-7g、let-7i和miR-98的表达量明显高于鳞癌组织，考虑本研究所使用的均为手术标本，均经严格的标本清洗及储存处理，而且本研究样本量44例高于FASSINA等研究的所采用的针吸标本组织31例，故认为本研究结果更可信。

表4 let-7a-1和let-7c基因与各临床相关指标之间的关系

本研究结果显示，Let-7c在肺癌组织中的表达与淋巴结转移、分化程度有关，与ZHAO等[19]的报道一致，也与耿淼等[20]在乳腺癌和ZHU等[21]在肝癌细胞中体外及体内实验结果一致，但具体作用机制有待进一步研究。ZHAO等[19]认为肺癌的转移与let-7c下游靶基因整合素β3和丝裂原蛋白激酶激酶激酶激酶3有关，这给肺癌的淋巴结转移途径研究提供新的证据。对于本研究发现的let-7c与吸烟、TNM分期无关，尚未见文献报道，其发生机制我们将进一步探讨。与之不同的是let-7a1则与吸烟、TNM分期明显相关，而与淋巴结转移无关。另外let-7a1在肺癌中的表达随分化程度越差其表达明显减低。同时本研究结果还显示，let-7a1表达在一定程度上与吸烟相关，有吸烟史者表达减低，这与IZZZOTTI等[22]研究的烟草暴露环境中小鼠的肺组织上皮细胞let-7表达下降的结果基本一致。

目前关于let-7在肺癌中的治疗价值主要集中在以下几方面：(1)含铂两药方案一直是肺癌的标准化疗方案，但有效率较低，客观缓解率为29.2%～36.4%[23]。最近有研究[24]认为肺癌细胞对铂类药物的耐药可能也与let-7和miR-29对Cockayne syndrome protein B的调节有关。(2)针对非小细胞肺癌中上调let-7基因的研究认为高迁移率族蛋白A2 mRNA是let-7b的功能性小分子RNA，在HCC827细胞的的体内外研究结果都表明能使其特异性沉默，因此认为let-7可能是潜在的肿瘤治疗靶点[25]。另有研究[26]发现miR-203通过抑制LIN28B和促进let-7的生物合成，在抑制肺癌细胞增殖和促进凋亡方面发挥了重要作用。(3)靶向治疗一直是非小细胞肺癌治疗的热点，特别是EGFR-TKIs的临床应用，给病人带来了无进展生存期的获益，改善了生活质量，但耐药不可避免，其分子机制尚不清楚。有研究[27]报道与吉非替尼敏感PC9细胞相比，吉非替尼耐药PC9/GR细胞let-7家族表达下调，miR-17家族表达上调。let-7和miR-17参与了非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药的调控，可作为预测非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药的生物标志物。(4)免疫检查点抑制剂是肿瘤治疗的一个最有前途的靶点，但客观应答率小于40%，并且对PD-1/PD-L1表达调控的机制知之甚少。CHEN等[28]研究发现let-7能够抑制PD-L1表达，而LIN28是一种RNA结合蛋白，在大多数癌细胞中上调，抑制let-7的生物合成，从而促进PD-L1的表达。因此，抑制LIN28可能是预防癌细胞免疫逃逸的一种策略。因此let-7已成为肿瘤治疗和免疫应答的关键分子，本身也具有潜在的免疫治疗靶点作用[29]。

LI等[30]通过Meta分析探讨microRNA let-7在肺癌中的预后作用也发现let-7的低表达提示整体生存率低，危险比为1.55(95%CI：1.16～2.09，P<0.05)。let-7的低表达与肺癌病人预后不良密切相关。

综上，let-7a1和let-7c基因在肺癌组织中低表达，并且随临床分期进展、淋巴结转移呈明显下降趋势，提示两者与肺癌的发生、发展及转移密切相关，let-7a1和let-7c可能成为肺癌早期诊断生物标记因子，并可能成为肺癌的靶向治疗新的靶点，为高危人群的早期干预提供实验依据。