柑橘青霉病防治的研究进展

徐明玉，杜春梅

（1黑龙江大学，农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨150500 2黑龙江大学生命科学学院，黑龙江省普通高校微生物重点实验室，哈尔滨150080）

0 引言

柑橘(Citrus reticulateBlanco)在在全世界的种植面积高达670万hm2，是世界产量最高的水果。2015年，世界柑桔产量约为1.21亿t，占水果总产量的20.0%[1]。中国柑橘的种植面积居世界第一，产量居世界第三，是中国南方主要的经济来源之一。中国的柑橘主要以鲜销为主，但在柑橘采后的储藏与运输过程中，容易发生霉变、腐烂，造成不可估计的经济损失。柑橘青霉病是造成柑橘损失的主要采后病害之一，意大利青霉(Penicillium italicum)主要引起柑橘的蓝霉病，指状青霉(P.digitatum)主要引起柑橘的绿霉病，统称为柑橘青霉病。目前，对柑橘青霉病的防治主要采用物理、化学和生物防治的方法，各种方法都有其优缺点。本文回顾了柑橘青霉病防治方法的研究进展，以期能为制定高效、安全、方便、成本低的综合治理策略提供参考依据。

1 物理防治

物理防治柑橘青霉病的主要优点是在果实表面几乎无残留、对人体伤害小、对环境无污染等。主要采用热、光、臭氧、冷藏、离子流处理等方法来抑制柑橘青霉病的发生和发展。但是往往效果有限、作用持久性不佳，有些处理还需要采用特殊装置，成本过高。

1.1 热处理

柑橘类水果的热处理主要采用热水浸泡和微波热处理，Williams等首次发现柑橘在45℃热水中浸泡42 min可以抑制意大利青霉与指状青霉孢子萌发。近几年，热水浸泡方法得到进一步改良。2016年Sui等[2]研究表明，在高于40℃低于60℃的条件下将柑橘进行几秒钟的热水浸泡处理，可以达到抑制病原体的效果。2020年Diana等[3]报道，微波热处理可以有效地防止青霉病的发生，对果实的pH、颜色、总可溶性固形物(TSS)没有影响，但是对柑橘的口感影响较大；而热水浸泡处理对水果的pH、柠檬酸含量等没有影响，能有效的抑制霉菌生长，但对柑橘的外观造成了一定影响。因此，在采用热处理时工艺时，需要充分的考虑对果实品质的影响，以达到最佳的处理效果。

1.2 光处理

紫外光(UV)和蓝光对柑橘青霉病菌具有抑制作用。2013年Cote等[4]发现用一定强度的UV-C照射，既可以抑制霉菌的生长，还能最大限度的保证果实的品质。UV-C主要是通过诱导水果中过氧化氢酶和几丁质酶的积累来提高水果的抗病性。2015年Gündüz等[5]使用剂量为0.26 kJ/m2的UV-C处理柑橘，发现指状青霉和意大利青霉的孢子数量显著减少。2016年Yamaga等[6]和Ruiz等发现UV-B对柑橘表面青霉菌具有抗菌活性，Ruiz等在2019年证明利用UV-B辐射柠檬可以增加果实中黄酮总酚类化合物和类黄酮的含量，防止柠檬发生青霉病。Cerioni等[7]证明柠檬黄酮提取物对指状青霉具有体外抗菌活性，而UV-B辐射处理的水果提取物的抗菌活性显著增强。María等[8]证实LED蓝光能控制采后柑桔果实青霉菌的生长，并且效力随着照射时间的延长和光量子通量的增加而提高，老的菌丝体对蓝光更敏感，高蓝光量子通量[700 μmol/(m2·s)]照射可以完全抑制各种青霉菌孢子的萌发，且蓝光对人体无害，更具有可行性。

1.3 臭氧处理

臭氧也可以控制柑橘青霉病。Harding等首次发现将柑橘类水果放置在敞开的箱子中暴露于2.14 mg/m3的臭氧下15天，柑橘青霉病得到了良好的控制。Palou等发现将感染指状青霉和意大利青霉的柑橘暴露在0.3～1.0µL/L浓度的臭氧下，可以有效抑制两种青霉的孢子萌发和菌丝生长。臭氧对青霉孢子萌发的抑制效果与臭氧和柑橘的接触面积有关，在12.8℃，臭氧浓度为1.54 mg/m3的条件下，使用通气的可回收塑料容器(returnable plastic containers，RPCs)可有效地抑制柑橘青霉病的孢子萌发[9-10]。2018年，García等[11]研究发现连续使用60 mg/kg臭氧和间歇使用1.6 mg/kg臭氧可有效延迟腐烂和柑橘青霉病的发生，同时还降低了柑橘硬度和重量损失，此外还发现臭氧对水果品质无害。

1.4 冷藏及离子流处理

有研究表明在10℃时意大利青霉的生长速率明显高于指状青霉，因此柑橘在3～5℃冷藏时，对意大利青霉和指状青霉都有抑制作用。但冷藏只能延长或减缓病原体的发展，不能完全抑制病害的发生。2016年Liu等[12]设计了一种水-空气微型空心阴极放电装置用于灭活指状青霉，抑制率为91%。但该方法操作成本过高，目前在经济上并不可行。

2 化学防治

化学防治是最常用的柑橘青霉病防治方法，具有防治效果快、目的性强、价格低廉、持久性长等优点。通常采用单一药剂防治或多种药剂联合防治。但是，有些药剂容易造成残留，危害人体和环境安全。

2.1 单一药剂防治

2.1.1 苯类物质 嘧霉胺(PYR)又称甲基嘧啶胺、二甲嘧啶胺，是苯氨基嘧啶类杀菌剂，具有广谱性。PYR杀菌机理独特，通过抑制病菌纤维素酶、果胶酶等胞壁降解酶的分泌从而阻止病菌侵染，并杀死病菌，具有预防和治疗作用。Smilanick等[13]发现0.2～0.4 mg/L的PYR可以抑制指状青霉孢子萌发，在500 mg/L及以上浓度，柑橘青霉病的发生减少了90%以上，并且可用于控制对其他杀真菌剂已经具有抗性的指状青霉菌株。含有对羟基苯甲酸乙酯钠(SEP)成分的可食用涂层可以降低柑橘类水果绿霉病的发生率。2013年Pedro等[14]发现SEP对柑橘青霉病具有抑制作用并且在果实上残留较少，还发现对羟苯甲酯钠(SMP)对柑橘类水果的绿霉病和蓝霉病均具有抗菌活性。2016年Montesinos等[15]分别用5种食品添加剂，脱氢乙酸、二碳酸二甲酯、乙二胺四乙酸、乙酸钠和苯甲酸钠(SB)，来控制人工接种意大利青霉和指状青霉24h的柑橘霉变的发生，结果表明SB的控制效果最好。PYR、SEP、SMP、SB对环境低污染，低残留，可用于替代传统化学杀菌剂。

2.1.2 新型碳酸氢钾制剂(Karma)近几年，科学家发现有机和无机盐对几种水果的采后病害具有抑制作用[16-17]。Karma是一种新型的可溶性粉末碳酸盐制剂，含有85%(w/w)的碳酸氢钾和≤15%的十二烷基硫酸钠和多库酯钠。从2008年起，Karma在瑞士销售，主要应用于治疗水果和蔬菜的采后病害。Youssef等[18]证明0.35和0.25(w/v)浓度的Karma可以完全抑制青霉菌的生长，而且浸涂是最佳施用方式，病害发生抑制率可达79%。

2.1.3 雾化消毒剂 在柑橘包装厂中通常采用甲醛雾气熏蒸来控制指状青霉分生孢子的萌发，但甲醛会对环境和人体造成巨大的伤害。2014年Smilanick等[19]证明戊二醛(0.1 g/m3)、过氧化氢(4.4 g/m3)、柠檬三醇(1.0 g/m3)、乙酸(5.3 g/m3)、过氧乙酸(2.4 g/m3)熏蒸24 h后，均能抑制95%以上指状青霉分生孢子的萌发，效果与甲醛相当。可以用做柑橘包装厂中甲醛的替代品。

2.2 联合防治

多种药剂联合使用可以明显改善单一药剂作用不全面的问题，使药效持久性增加、残留量降低、防治效果明显提高。山梨酸钾是一种具有广谱杀菌性的食品防腐剂，但是单独施用于柑橘水果时，防效不明显且易残留。D'Aquino等[20]选用山梨酸钾与噻苯唑在53℃联合施用于柑橘水果，发现二者联用对指状青霉菌的治疗效果显著提高，且明显减少了柑橘表面残留物的量。由于在20世纪70年代后大量应用苯并咪唑类内吸性杀菌剂，如抑霉唑等，使绿霉病菌对此类药剂产生了抗性。而以较低浓度的抑霉唑与茶皂素按比例施用于柑橘水果可以更好地控制青霉菌，延缓抗性菌株的产生[21]。

3 生物防治

生物防治具有较高的安全性，有可能逐渐替代传统化学防治剂，但是目前的生物防治剂还有一些亟待解决的问题，如防效的稳定性、高效性还不如化学农药。柑橘青霉病的生物防治剂主要来源于植物提取物和微生物。

3.1 植物提取物

3.1.1 植物精油 植物精油可有效地治理柑橘青霉病，由于具有易挥发、可生物降解、无害、甚至可食用等优点，更易被消费者接受[22]。近年来，环保型精油(Eos)大面积应用为天然食品防腐剂。其中，香茅、月桂叶、柠檬草和肉桂的精油均表现出对水果采后真菌病原体的抑制活性。

来自于柑橘的精油对指状青霉和意大利青霉具有较强的抑制作用[23]。2014年，Tao等[24]采用气相色谱-质谱联用技术分析了柑橘精油的化学成分，将对意大利青霉的抗菌活性归因于香茅醇、辛醛等，而对指状青霉的抗菌活性归因于柠檬烯、柠檬醛等。辛醛能明显改变指状青霉和意大利青霉菌丝的形态，破坏膜通透性，引起细胞质损失。能诱导柑橘中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性，提高其抗病性[25]。柠檬醛可以抑制意大利青霉和指状青霉分生孢子的生长，可以有效控制柑橘青霉病的发生，利用柠檬醛熏蒸可以延缓柑橘变质，延长储存时间[26]。

将精油微乳化或与蜡混用可有效防治柑橘青霉病。丁香精油(CEO)能抑制意大利青霉和指状青霉的生长和分生孢子的产生[27]，2016年He等[28]发现微乳化能使CEO的抑真菌活性增强，施用微乳化的CEO能使柑橘的腐烂发生率比纯精油处理的降低了34.51%。反式肉桂醛(CA)是肉桂油的主要成分，抗真菌活性强，但高挥发性限制了其应用，段等将CA与蜡结合对柑橘水果进行处理，可以显著降低由指状青霉引起的柑橘果实采后腐烂的发生率，提高了柑橘果实抗氧化酶和防御酶的活性，以及总酚和类胡萝卜素的含量[29]。Fan等[30]发现在25±2℃条件下，用蜡+柠檬醛处理可显著降低贮藏6天后指状青霉的发生率，维生素C的含量和抗氧化酶的活性显著增加。

3.1.2 大蒜和龙葵提取物 早在1988年Garcia等就已经发现大蒜蒜瓣提取物具有一定的抗真菌活性。最近，Obagwu等[31]研究表明大蒜蒜瓣的乙醇提取物和水提物对指状青霉和意大利青霉有控制作用，处理过的水果在10±1℃和90%～95%的相对湿度下可存储30天，且乙醇提取物效果优于水提物，大蒜提取物与植物食用油混合后的抗菌活性显著增加，与化学杀菌剂（抑霉唑）效果相当。除此之外，Musto等[32]研究发现龙葵叶片粗提物具有预防性抗青霉菌作用，且在4℃下保存60天，体外抗真菌活性不变。

3.2 微生物

3.2.1 细菌 用于柑橘青霉病防治的细菌种类较多，主要分布在芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳杆菌属(Lactobacillus)以及沙雷氏菌属(Serratia)。

早在1992年就已经有报道表明芽孢杆菌属可用于防治柑橘青霉病。黄勇等人证明短小芽孢杆菌(B.pumilus)可以显著抑制柑橘表面指状青霉的生长，且防治效果与抑霉唑效果相当，明显优于苯菌灵，并且较低浓度也可显著抑制指状青霉的生长。2008年Leelasuphakul等[33]发现9个芽孢杆菌土壤分离株的培养上清液对指状青霉生长均显示出80%的抑制作用，其中枯草芽孢杆菌155抑制效果最好。2011年刘等采用研磨液培养法从橘皮中分离到26株内生细菌，从中发现1株枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的拮抗作用最明显，抑菌圈达到了15.3 mm。2013年Tu等[34]从金桔果实表面分离出类芽孢杆菌(Paenibacillus brasilensis)YS-1，用YS-1的无细胞滤液和细胞悬液处理能使柑橘青霉病发生率均低于45%，病灶直径均在10mm以下。采前处理与采后处理相结合，YS-1发酵液可显著降低南丰柑的腐烂率[35]。

2011年，Demirci等[36]从柑橘表面分离到176株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，其中有40株荧光假单胞菌分离物能阻止柑橘表面青霉病斑的发展。2017年Tremonte等[37]报道了乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)对不同真菌菌株的抑制能力。Gerez等[38]从33株LAB菌株中分离出8株对指状青霉具有抗真菌活性的菌株。Kamensky等[39]从甜瓜根周围的土壤中分离得到抗真菌病害的沙雷氏菌S.plymuthicaIC14，可显著抑制指状青霉的分生孢子萌发。不同的沙雷氏菌菌株抑菌作用机理不完全相同，S.plymuthicaIC14的抑制作用似乎取决于直接的相互作用，而争夺养分则似乎是S.plymuthicaIC1270菌株的主要作用方式。

3.2.2 真菌 应用于柑橘青霉生物防治的真菌主要是酵母。酵母能够在受伤的组织中定殖并快速生长，对营养要求简单，还能够在干燥的表面上长期生存，这些特点赋予了酵母作为生物防治剂的特殊优势[40]。

早在1989年Wilson等就已经通过实验证明汉森酵母(Debaryomyces hansenii)对植物无致病性，并且可以在不产生抗生素的情况下控制柑橘指状青霉的生长，由此发现了酵母菌对柑橘青霉病生物防治所具有的商业价值。

某些酵母能在柑橘表面形成酵母拮抗剂，大部分酵母拮抗剂都可以抑制柑橘青霉的生长。2005年Long等[41]发现，柠檬形克勒克酵母(Kloeckera apiculata)34-9菌株浓度为3×108cfu/mL时可以完全控制3×105个孢子/mL的意大利青霉的生长，柑橘果实创伤部位的酵母菌数量可以增加40倍，并对柑橘果实无致病性。2010年Abraham等[42]从番木瓜和柑橘果实表面分离到60株酵母菌，其中2个酵母分离物（B13和Grape）可以有效预防65%柑橘水果的腐烂。2012年Platania等[43]发现在酸化培养基上生长的杀灭性酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和柳条孢酵母(Wickerhamomyces anomalus)对指状青霉均有抑制作用，并且柳条孢菌菌株BS 91和BS 92可使病害程度分别降低至1%和4%，果实存放时间可延长至10天。汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)可有效控制柑橘果实中的真菌病原体[44]，D.hansenii菌株DhhBCS03、DhhBCS05、DhhBCS06、LL1和LL2在室温下，中剂量(1×106cell/mL)和高剂量(1×108cell/mL)均可以有效降低果实中指状青霉感染的严重程度，防治效果与抑霉唑相当，高剂量可以更好地延长水果冷藏时间。红冬孢酵母(Rhodosporidium paludigenum)可以诱导柑橘类水果对指状青霉的抗病性，防御相关酶的活性显著增强，在人工接种指状青霉前48～72 h施用红冬孢酵母，柑橘类水果的发病率和病害严重程度显著降低，1×108和1×109cell/mL浓度处理可使指状青霉感染率分别降低49.6%和52.5%[45]。Liu等[46]从中国重庆橘园分离到8个种属71株拮抗酵母菌，有45个分离株对指状青霉有拮抗活性，其中的梅奇酵母(Metschnikowia zizyphicola)FL02可完全抑制指状青霉的生长。2018年，Cunha等[47]对从土壤、叶片、花卉和柑橘果实中分离到的6株抗意大利青霉菌的有效酵母进行筛选，发现6株酵母菌对病原菌的菌丝生长抑制率均高达90%，效果最好的菌株是酿酒酵母(S.cerevisiae)ACBL-11和ACBL-14。Perez等[48]在2018年发现使用杀手酵母(killer yeasts)可以作为柠檬收获后真菌疾病的生物防治剂，随后在2019年发现杀伤性葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)146具有在柠檬中定殖伤口并在低温和室温下继续生长的能力，可以抑制指状青霉的孢子萌发，在25℃下在天然蜡中可以生存7天，在8℃下可以生存40天，是一种具有广泛市场应用前景的杀手酵母[49]。

3.2.3 抗菌肽 壳聚糖寡糖和抗菌肽(AMPs)对柑橘青霉病有防治效果[50]。AMPs是基因编码的核糖体合成的多肽，广泛存在于许多生物中。尽管AMPs的长度、序列和结构不同，但大多数都是阳离子性和两亲性的。由于对微生物的作用时间短并且对哺乳动物和植物细胞的毒性低，AMPs将是抗生素和杀真菌剂的优良替代品。抗菌肽MSI-99已被证明可有效控制水果病害。PAF26（氨基酸序列RKKWFW)是一种人工设计的六肽，其序列与其他天然和人工合成的AMPs相似，能有效控制柑橘果实上的绿霉病。PAF56（氨基酸序列GHRKKWFW）是从PAF26衍生而来的短阳离子抗菌肽，在N端有一个甘氨酸和一个组氨酸残基的延伸，对某些丝状植物病原体具有抗菌活性。2018年Wang等[51]证明PAF56对指状青霉、意大利青霉和白地霉(Geotrichum candidum)引起的果实绿霉、蓝霉和酸腐病均有防治效果，为PAF56的商业应用提供了有价值的信息。

4 展望

目前对柑橘青霉病主要采用的还是化学防治方法，虽然化学方法可以很快地抑制病原体发展，但会造成一些副作用。如药剂在果实上残留会对人体健康甚至生态环境造成危害，而且容易使病原菌产生抗性。物理方法主要对柑橘表面的病害有效果，且效果不如化学方法，有时需要特殊的设备。使用生物方法防治柑橘青霉病安全性好，但是在商业化和工业化应用上，还存在一些亟待解决的问题，如成本高，见效慢等。因此，对柑橘类果实储藏期病害进行高效安全的综合治理还存在一定的难度。为了进一步有效的控制柑橘青霉病的发生，今后可从以下几个方面开展后续研究：（1）进一步探究柑橘青霉病菌对柑橘果实的致病机制，为预防柑橘青霉病的发生和阻断其发展提供新的靶点；（2）深入研究生物源制剂对柑橘青霉病的防控机理，为推进生物防治策略的应用进程提供有效依据；（3）积极探索生物防治方法与化学或物理防治方法联用的防治效果，为建立良好的综合防治管理策略和最大化提高防控效果奠定基础。