联合阻断PD-1及TIM-3分子抗肿瘤相关研究进展

韩得婷，宋鲁成

[1.山东中医药大学 第一临床医学院，济南 250014；2.山东省千佛山医院(山东第一医科大学第一附属医院) 山东省名老中医传承工作室，济南 250014]

肿瘤是全球范围内严重威胁人类健康的重大疾病之一，随着相关研究的不断深入，除传统的放疗、化疗、手术等治疗方法，近些年也出现了包括免疫治疗在内的新疗法。近年来，免疫检查点在肿瘤领域的重要性得到普遍重视。尽管机体内存在细胞免疫、体液免疫等免疫机制，仍然有少量的肿瘤细胞可逃避其监视，发生“逃逸”，进而不断增殖和侵袭。因此，免疫逃逸在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用[1]。国内外诸多专家发现，肿瘤细胞通过干扰正常免疫检查点信号，削弱机体免疫反应进而利于自身免疫逃逸[2]。免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor， ICI)通过阻断免疫负调节信号激活宿主的抗肿瘤免疫应答，从而减少肿瘤的免疫逃逸，是很有前景的肿瘤免疫治疗方式。但单一的ICI治疗在一段时间后可能出现耐药性，因此，为增强疗效，使更多患者受益，探索联合疗法迫在眉睫[3]。本文尝试从免疫学角度阐释检查点PD-1及T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T-cell immunoglo-bulin mucin 3，TIM-3)在各类肿瘤组织中的表达及作用机制，同时对未来联合应用PD-1及TIM-3抗体治疗肿瘤作展望。

1 PD-1及TIM-3分子的结构与作用机制

PD-1为CD28超家族成员，主要表达于T细胞、B细胞和骨髓细胞表面，可抑制T细胞活化并下调效应期淋巴细胞的功能。另外，已有6种抗PD-1抗体获得美国FDA批准上市[4]。TIM-3是TIM家族成员，高表达于T细胞、NK细胞、NKT细胞、Th1和CTL表面，能产生抑制性信号导致Th1、CTL凋亡。PD-1及TIM-3是协同刺激分子家族重要成员，均属负调控因子，不仅参与调节自身免疫过程，而且在肿瘤免疫中也发挥重要作用。PD-1和/或TIM-3在实体瘤组织T细胞表面高表达，抗体阻断PD-1和/或TIM-3信号通路能使肿瘤特异性T细胞的抗肿瘤活性恢复；沉默PD-1和/或TIM-3可抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡。因此，PD-1及TIM-3分子在肿瘤的发生、发展、增殖及凋亡中发挥重要作用[5]。

2 PD-1及TIM-3分子在CD4+和CD8+T细胞表面的表达

PD-L1阳性肿瘤组织中CD8+T细胞增殖率明显提高，CD4+Foxp3+Treg百分比更高，CD4+和CD8+T细胞表面PD-1及TIM-3分子表达增加[6]。此外，TIM-3分子在Foxp3+Treg亚群表面被证明是上调的[7]。

PD-1及TIM-3在CD4+T细胞表面共表达是CD4+T细胞特异性效应/记忆亚群的特征，这些细胞优先分泌Th2型细胞因子并在母胎界面表现出较强的抑制增殖能力，帮助维持正常妊娠[8]。PD-1+CD244+或PD-1+及TIM-3+CD57+CD8+T细胞水平的升高可能是导致多发性骨髓瘤(multiple myeloma， MM)组织中T细胞活化及其免疫功能低下的主要原因之一。此外，检测MM细胞中PD-L1和Gal-9的表达水平可能为MM患者制定精准的检查点阻断治疗策略提供依据[9]。HBV感染后，PD-1、TIM-3、CD160和CTLA-4抑制性受体持续高表达，出现CD8+T细胞功能障碍[10]。在T细胞激活过程中，TIM-3和PD-1能有效促进纽约食管鳞状细胞癌抗原1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1， NY-ESO-1)特异性CD8+T细胞增殖和细胞因子产生，提示NY-ESO-1特异性CD8+T细胞的抗肿瘤作用可能通过针对这些抑制性受体的靶向治疗得到改善[11]。联合阻断PD-1/PD-L1和TIM-3/Gal-9互作可能有助于预防晚期急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia， AML)等恶性血液病患者CD4+、CD8+T细胞耗竭[12-13]，减少免疫抑制及化疗耐药[12]。PD-1+TIM-3+和PD-1hiTIM-3-肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)功能十分紊乱，而PD-1intTIM-3-TIL在增殖能力和细胞因子产生方面更活跃，这些结果更好地解释了TIL亚群的功能状态以及PD-1和TIM-3在肿瘤免疫治疗中调节抗肿瘤TIL反应的作用机制[14]。

3 PD-1及TIM-3信号通路对细胞因子分泌的调控

联合靶向TIM-3及PD-1通路不仅促进了CD8+T细胞IFN-γ和TNF-α的分泌，而且促进了其增殖[15]。总之，TIM-3/Gal-9和PD-1/PD-L1阻断治疗能逆转结直肠癌患者肿瘤诱导的T细胞耗竭和功能障碍[15]。PD-1+TIM-3+CD8+T细胞产生的IFN-γ水平显著低于PD-1-TIM-3-、PD-1+TIM-3-CD8+T细胞。胃癌患者PD-1+CD8+和TIM-3+CD8+T细胞数量的增多与CD8+T细胞功能受损密切相关[16]。

核受体第4亚族A组成员1(nuclear receptor subfamily 4 group A member 1， NR4A1)的识别为T细胞功能障碍诱导的关键，是可用于肿瘤免疫治疗的潜在靶点[17]。PI3K和MAPK信号通路均参与PD-L1表达的调控。PD-L1启动子含有针对IRF1、HIF-1α和STAT3的调控元件。miR-570、miR-513、miR-34a和miR-200等miRNA都参与PD-L1表达的负向调控。肿瘤微环境中的炎症活动被认为是一个中心驱动因子，转录因子IRF1主要负责组成型和IFN-γ诱导型PD-L1表达的调控[18]。

4 PD-1及TIM-3分子与肿瘤的关系

许多肿瘤相关抗原被确认为自身免疫系统的抗原成分，因此肿瘤免疫在某种程度上即是自身免疫，而自身免疫耐受可能阻碍抗肿瘤免疫过程。目前的研究发现，Treg在自身免疫耐受的建立中扮演着重要角色，它的缺陷和功能失调将直接引起自身免疫性疾病[19]。

在对抗PD-1治疗产生耐药性患者的T细胞中检测到较高水平的TIM-3，这表明，在抗PD-1治疗过程中，治疗失败与免疫检查点TIM-3表达的上调有关，其可限制抗肿瘤免疫应答水平[20]。

4.1 PD-1及TIM-3分子在黑色素瘤、肾癌、肺癌、头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)组织中的表达CTLA-4和PD-1等免疫检查点分子的阻断治疗已在黑色素瘤、肾癌、霍奇金淋巴瘤和肺癌中取得了持久的疗效，然而治疗的成功率一直很低，包括结直肠癌在内的多种肿瘤仍在很大程度上对CTLA-4和PD-1阻断治疗耐受。TIM-3是一种共抑制性受体，在IFN-γ+T细胞、Foxp3+Treg和固有免疫细胞(如巨噬细胞和DC)表面表达。抗TIM-3抗体作为一种潜在的肿瘤免疫治疗候选药物地位关键[21]。

PD-1及TIM-3双阳性耗竭T细胞表型在抗PD-L1单独治疗3周肿瘤复发后出现，增加抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)抗体靶向治疗后可被清除[22]。VEGF-A增强了T细胞表面抑制性受体TIM-3的共同表达，提示VEGF在小细胞肺癌(small cell lung cancer， SCLC)患者抗PD-1靶向治疗中发挥抗免疫抑制作用。抗VEGF和抗PD-L1抗体联合应用或可成为SCLC有效的治疗策略[22]。PD-1或TIM-3的单一阻断，特别是与溶瘤病毒(oncolytic virus，OV)治疗结合时，会相应增加T细胞表面TIM-3或PD-1的表达，表明肺癌对OV免疫治疗联合抗PD-1或抗TIM-3抗体单一阻断治疗产生了耐药性。然而，OV治疗联合PD-1或TIM-3阻断剂在肿瘤动物模型中有显著疗效，这为难治性及其他类型肺癌，特别是产生耐药性的肺癌患者治疗提供了强有力的依据[3]。绝大多数黑色素瘤疫苗可诱导CD8+T细胞表面PD-1的表达上调，少数也上调TIM-3的表达。PD-1及TIM-3的双重阻断促进了疫苗诱导的CD8+T细胞的体外扩增和细胞因子产生。因此，联合黑色素瘤疫苗及PD-1和TIM-3阻断剂可刺激有效的抗肿瘤T细胞反应，并增加晚期黑色素瘤患者出现临床治疗反应的可能性[23]。VEGF能诱导CD8+T细胞表面PD-1及TIM-3分子的表达，TIM-3在肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma， ccRCC)组织中高表达，TIM-3、PD-1分子共表达对肾癌患者TIL的功能发挥有重要生物学及临床意义[24]。TIM-3通过影响GATA3，在促进SLE或ccRCC致病细胞侵袭潜能方面发挥作用，提示TIM-3可能是治疗SLE或ccRCC的潜在靶点[25]。阻断PD-1及TIM-3可能会增强基于西妥昔单抗的抗肿瘤免疫治疗，逆转TIL功能障碍，从而改善HNSCC患者的临床预后[26]。

4.2 PD-1及TIM-3分子在肝癌组织中的表达在体外直接阻断TIM-3和PD-1能显著增强TIL 的增殖能力及IFN-γ和TNF-α释放量。TIL表面TIM-3和/或PD-1的表达破坏了其正常功能，与原发性肝癌(primary hepatic carcinoma， PHC)患者的无病生存率负相关[27]。直接阻断TIM-3和PD-1分子可恢复TIL的抗肿瘤作用，为HBV相关性肝癌新的免疫治疗方法的探寻提供潜在靶点[27]。Gal-9对IFN-γ分泌的负性调节作用影响T细胞在人和小鼠体内的免疫调节能力。与正常肝组织或外周血T细胞相比，免疫检查点PD-1、TIM-3和淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3, LAG-3)在人肝癌组织中肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen， TAA)特异性T细胞表面表达上调，抗PD-L1、TIM-3或LAG-3抗体可恢复肝癌来源的T细胞针对肿瘤抗原的免疫应答，且上述抗体的组合具有加强效应，阻断PD-L1、TIM-3和LAG-3的策略可被开发用于肝细胞肝癌(hepatic cell carcinoma, HCC)的治疗[28]。免疫检查点TIM-3、PD-1和T细胞表面CCR5的表达调控与PHC有一定关联。CD8+T细胞表达的PD-1与PHC预后(总生存时间和治疗反应)最相关，可能是一种很有前景的HCC免疫治疗靶点。PD-1+B细胞和TIM-3+CD4+T细胞可能在HCC的发病过程中发挥了重要作用[29]。

4.3 PD-1及TIM-3分子在其他肿瘤组织中的表达与正常结肠组织相比，包括PD-1、CTLA-4、TIM-3和T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains， TIGIT)在内的免疫检查点和包括PD-L1和Gal-9 在内的配体在结直肠癌组织中的表达均显著升高[30]。PD-1和TIM-3在Ⅰ～Ⅲ期结直肠癌组织中高表达可能与预后不良有关，两者共表达时，患者预后明显较差，主要原因可能是T细胞耗竭导致的肿瘤细胞转移[31]。TIM-3和癌胚抗原相关细胞黏附分子1(carcino-embryonic antigen related cellular adhesion molecule 1， CEACAM1)在CD8+T细胞表面的共同高表达标志着T细胞的高度功能失调，进而引起T细胞耗竭，它们的高表达是结直肠癌的独立危险因素，可成为该病免疫治疗的潜在靶点[32]。研究表明，抗PD-1单克隆抗体上调了抗肿瘤免疫基因和诱导肿瘤抑制/凋亡基因的表达水平，上调的基因通过MAPK信号通路参与免疫细胞增殖，通过调节细胞因子和趋化因子的表达参与免疫细胞激活、迁移过程，控制乳腺癌细胞的生长[33]。抗TIM-3抗体通过上调免疫细胞增殖/激活和T细胞毒性基因的表达以增强机体抗乳腺癌免疫功能，并通过下调JAK-STAT、Wnt信号通路相关基因抑制乳腺癌血管生成及肿瘤细胞生长、侵袭和转移[33]。T细胞经常聚集在神经组织周围的鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)中，其中一部分细胞表达PD-1/CTLA-4/TIM-3，在相应的血源性T细胞中未见表达，因此，神经组织周围的SCC病灶可采用抗体阻断疗法进行治疗[34]。下调TIM-3蛋白的表达抑制了HeLa细胞的迁移和侵袭，促进了宫颈癌细胞的转移潜能[35]。TIM-3分子在肿瘤细胞中的表达可能是宫颈癌患者的独立预后因素[35]。TIM-3在卵巢癌组织中表达上调，与M2型巨噬细胞密切相关。阻断TIM-3信号可增强细胞毒性，还可导致外周血NK细胞产生IFN-γ对抗肿瘤。研究发现，PD-1过表达抑制了卵巢癌的生长，促进了顺铂诱导的肿瘤细胞凋亡，从而增强了卵巢癌对顺铂的敏感性[36]。TIM-3常与PD-1共表达，与慢性病毒感染病灶和肿瘤组织的T细胞耗竭有关，阻断TIM-3或联合阻断TIM-3和PD-1可逆转T细胞耗竭，抑制肿瘤生长[27]。研究表明，TIM-3可作为评估肿瘤患者预后的生物标志物，是恢复NK细胞抗肿瘤反应性的潜在治疗靶点。然而，TIM-3的阻断降低了NK细胞介导的对胰腺癌细胞株的杀伤作用，阻断Gal-9 使与健康供者原代AML细胞共培养后的NK细胞的IFN-γ分泌减少[37]。TIM-3+、CTLA-4+和PD-1+PD-L1+可能是肿瘤复发的相关免疫讯号。在晚期甲状腺髓样癌组织中，抗TIM-3、PD-1/PD-L1或CTLA-4抗体联合阻断治疗可能是潜在的治疗策略[38]。

5 结语

综上所述，PD-1与TIM-3均参与了肿瘤的免疫调节反应，围绕免疫检查点在肿瘤治疗方面的研究较多，已有6种PD-1相关单抗药物用于国内外肿瘤临床治疗，但并未收到令人满意的疗效。在研究抗PD-1产生免疫耐受的同时，发现TIM-3分子高表达，因此，联合靶向TIM-3和PD-1途径比靶向单一途径更有效[39]。进一步研究ICI的作用机制以及如何开发有效的免疫检查点联合疗法以提高临床疗效及减少副作用，是未来研究的方向。