单细胞转录组测序技术在骨关节炎中的研究进展△

周 健，张子安，赵海波，于腾波*，张英泽

（1.青岛大学附属青岛市市立医院骨科；2.青岛大学附属医院骨科，山东青岛 266003）

骨关节炎（osteoarthritis,OA）是一种以关节软骨退变、软骨下骨重构以及滑膜炎症为主要特征的慢性退行性骨关节疾病，可以导致软骨细胞表型和软骨稳态发生改变，好发于髋、膝关节，临床表现为关节疼痛、关节僵硬，严重者可致关节畸形，导致关节活动受限，严重降低了患者的生活质量［1～2］。探索OA的分子发病机制，延缓OA进程，寻找新的诊断及预防手段，一直是骨科领域研究的焦点问题。传统的RNA测序技术（bulk RNA-seq）是将组织中的细胞RNA混合后进行分析，无法获取单个细胞的信息。单细胞转录组测序（single cell RNA sequencing,scRNA-seq）可以对组织中的细胞进行独立分析，在细胞图谱构建、细胞亚群细化及稀有细胞类型鉴定、疾病标志性致病基因及干细胞发育分化等过程中发挥重要作用。目前单细胞测序技术已经在肿瘤、心血管病、神经科学等诸多学科广泛应用［3～6］，但在骨关节领域，包括OA、类风湿关节炎（rheu⁃matoid arthritis,RA）、创伤性关节炎以及滑膜炎等疾病的研究还处于起步阶段。随着研究的不断深入，OA的分子发病机制与发病过程、细胞类型与疾病之间的关系、病变的软骨细胞如何再生等问题会有新的见解。本文对scRNA-seq技术及在OA方面的应用进行概述。

1 单细胞转组测序技术

scRNA-seq技术是从单个细胞水平获得全转录组的表达谱，可以揭示单细胞的基因表达情况、细胞间基因的交互调控网络，寻找细胞间异质性。真核细胞包含许多不同的RNA，目前以检测mRNA为主，长链非编码 RNA（lncRNA）和环状 RNA（circRNA）等也可被检测［7，8］。scRNA-seq分析的主要步骤包括单细胞分离→全转录组扩增→构建测序文库→高通量测序→数据分析。

1.1 单细胞分离技术

scRNA-seq的第一步是将目的细胞从样本中高质量的分离出来，常用的方法有：连续稀释法（serial dilution）、显微操作技术（micromanipulation）、激光捕获显微切割法（laser capture microdissec-tion,LCM）、荧光激活细胞分选法（fluorescence activated cell sorting,FACS）和微流控法（microfluidics）。FACS法可以根据细胞的特征进行快速分离，具有灵敏度高、准确度高、通量高等优点，但需要细胞初始样本量较大。目前常用的是微流控技术，有液滴式微流控和芯片式微流控两种方式，将细胞分离至纳升级的微容器中进行分离、捕获单个细胞，具有精准控制、所需求样本及试剂少、高分辨率和高灵敏度等特点，是目前单细胞分离最好的方法［9］。

1.2 单细胞转录组扩增技术

单细胞测序方法是基于DNA进行的，也就是需要将mRNA逆转录为cDNA进行扩增，其中关键点为：首先，尽量在逆转录过程中减少mRNA的损失；其次，扩增后要提供足够多的DNA进行测序［10］。自单细胞测序技术开发以来，相关新技术手段不断被开发出来，目前常用的扩增方法有模板转换法 SMART技术 （Smart-seq/Smart-seq2、STRT-seq）、体外转录扩增技术（CEL-seq/CEL-seq2、Quartz-seq）、微流体技术Drop-seq和inDrop技术。

1.2.1 SMART扩增技术

Smart-seq技术可以得到mRNA全长，能进行转录本异构体的分析。Smart-Seq2由Smart-seq基础上改进而来，可以增加单细胞的cDNA文库产量和平均长度，实现更高灵敏度，降低扩增偏倚［11］。

1.2.2 CEL-seq和CEL-seq2技术

是利用体外线性扩增单细胞转录组的方法。利用含有oligo-dT序列、独特条形码、测序接头和引物将单细胞RNA逆转录成合成cDNA一链、二链，通过体外线性扩增获得足够的cDNA构建文库［12］。CEL-seq2能减少扩增偏倚，具有更高的可重复性和灵敏度。

1.2.3 Drop-seq和inDrop微流控技术

Drop-seq和inDrop技术由哈佛大学开发，利用微流体技术结合scRNA-seq，使微珠直接捕获mRNA，在一个液滴中完成全部反应，产物浓度更高，且成本更低［13］。

1.3 单细胞测序文库构建

文库构建是转录组扩增之后的一个关键步骤，首要解决的问题是用mRNA准确建库，避免扩增偏倚，提高灵敏度和可重复性，并获得细胞追溯来源。文库构建的核心技术是捕获目标样本内的总RNA，关键步骤是全转录组扩增，将RNA完全逆转录成cDNA，再进行线性扩增，获得足量cDNA用于构建文库。扩增完成后检查扩增片段大小及扩增产量是否合格，对文库进行浓度和峰型检测，质检合格后做成Illumina测序文库。不论选择哪种方法，只有高质量的文库才能得到高质量的数据。

1.4 单细胞转录组高通量测序及平台

高通量测序技术可以一次对数百万个DNA分子同时进行测序，主要为全长（full-length）测序与基于标签（tag-based）测序［14］。目前常用的单细胞测序平台有10xGenomics Chromium单细胞平台、BD Rhapsody™单细胞分析系统、Illumina®Bio-Rad®和ICELL8单细胞分析平台、C1™单细胞全自动制备系统。10xGenomics Chromium单细胞平台利用与Dropseq相似的技术原理进行测序，能够高效的进行单细胞标记、测序及分析，在短时间内每个样本可以测得几万个细胞的转录组信息，成本低，应用广泛。BD Rhapsody单细胞分析系统基于微孔技术，使一个微孔中通过一个细胞，提高了捕获单细胞的效率，使用分子标签技术，可实现靶向测序，具有转录更加准确、检出率更高等优势。

1.5 单细胞转录组测序的数据处理及分析

高通量测序后在数据分析前必须进行质量控制，剔除可能存在偏差的测序数据，提高数据分析的精度和效率。scRNA-seq数据分析流程包括数据预处理、细胞和基因水平的后续分析，常用的预处理策略主要有核酸文库标准化、质量控制、表达矩阵的归一化、数据校正、降维等［15］。后续数据分析主要是利用生物信息学手段将所得到数据进行过滤和标准化后的可视化处理，基于过滤后获得高质量的细胞基因表达谱，对细胞进行差异基因分析、聚类分析、细胞轨迹推测、寻找marker基因、细胞相互作用、功能富集等。

2 单细胞转录组测序在OA领域的应用价值

2.1 在骨关节软骨细胞中的应用

软骨组织中，软骨细胞为其中唯一的细胞成分，在细胞外基质代谢和维持软骨组织稳态中发挥重要作用，由间充质干细胞分化而来［16］，分为透明软骨、纤维软骨及弹性软骨。研究表明关节软骨中的软骨细胞可以分为增殖性软骨细胞（ProCs）、衰老细胞（SnCs）、前肥大性软骨细胞（preHTCs）、肥大性软骨细胞（HTCs）和软骨祖细胞（CPCs）［17-20］，不同的软骨细胞亚型具有不同的功能，并且软骨细胞的表型改变能够导致骨关节炎软骨退变的发生［21］，衰老细胞具有细胞周期阻滞和衰老相关分泌表型特征，局部清除后可以延缓创伤后骨关节炎的进展［18］。软骨祖细胞主要作用是维持细胞的自我更新，并可以多向分化，表达干细胞相关表面的标记，有助于OA软骨细胞的修复［22］。Ji等［23］研究发现了软骨细胞的3个新表型细胞群，这几种细胞均是早期OA软骨细胞，其中，稳态软骨细胞（HomCs）被发现与生物节律有关。前肥大性软骨细胞及肥大性软骨细胞主要为晚期OA软骨细胞，而稳态软骨细胞分布于整个OA过程。效应软骨细胞、调节性软骨细胞和稳态软骨细胞可能保护软骨不发生OA，而增殖性软骨细胞、前肥大性软骨细胞可能促进OA进展。一项对3例健康人半月板的研究发现，半月板软骨细胞分为7个亚型，其中包括2个新亚型。7个软骨细胞群分别为内皮细胞（EC）、软骨祖细胞（CPC）、调节性软骨细胞（RegCs）、纤维软骨细胞（FC）、增殖前软骨细胞（PreHTC），纤维软骨细胞祖细胞（FCP）和增殖纤维软骨细胞（ProFC）。拟时序分析确定了内皮细胞及纤维软骨细胞祖细胞处于起始处，并验证确定了两者具有祖细胞特性［24］。半月板中的祖细胞被认为具有促进半月板损伤修复的功能［25］。

2.2 在骨关节滑膜细胞中的应用

滑膜细胞有A、B两种类型，巨噬细胞样A型细胞和成纤维样B型滑膜细胞，具有分泌滑液减少关节软骨的摩擦系数和吸收作用及吞噬功能。研究表明滑膜成纤维细胞和单核巨噬细胞是RA等炎症性关节疾病以及导致骨关节破坏的因素［26～28］。一项关于滑膜成纤维细胞介导炎症及关节损伤的研究表明，成纤维细胞活化蛋白、成纤维细胞的两个亚型（破坏性成纤维细胞和免疫效应成纤维细胞）具有不同的功能，前者可以选择性地介导骨与软骨损伤，对炎症几乎没有影响，而后者导致关节炎加重，对骨和软骨的影响最小［29］。研究发现滑膜成纤维细胞分为3种主要细胞亚群，并且在RA患者中的滑膜成纤维细胞亚群较OA患者增加了3倍，两类患者的滑膜成纤维细胞具有相似的转变过程，同时也具有异质性［30-32］。Zhang等［33］研究发现了4种成纤维细胞亚群、4种单核细胞亚群、4种B细胞亚型的特征。OA患者多伴有滑膜组织炎症，scRNA-seq可以在单细胞水平上分析OA患者不同时期滑膜组织细胞的异质性，发现新的滑膜细胞亚群，为OA的分子病理诊断及靶向治疗提供新的标准。

3 单细胞转录组测序的优势与不足

与传统的bulk测序方法相比，scRNA-seq能够检出单个细胞间的异质性信息，准确记录细胞空间位置及谱系分化轨迹，发现微量基因表达或罕见非编码RNA；从单细胞水平上了解OA的分子发病机制，为靶向治疗OA提供了依据。但scRNA-seq操作过程相对繁琐，对细胞悬液活性要求高，技术噪音高，且目前的检测主要集中在mRNA，对于非编码RNA检测仍有困难；在骨科领域存在着许多挑战，如软骨细胞单细胞制备、储存、扩增等较一般细胞困难，目前尚缺乏实验设计和实验分析的统一标准流程。

4 展 望

随着scRNA-seq技术的迅速发展，高通量技术及转录组扩增技术的日臻完善，针对scRNA-seq的数据分析工具和软件也更强大，在OA领域的研究会更加深入。结合单细胞多组学及空间转录组的信息，可以全面分析OA的分子发病机制及病理分期，发现新的治疗靶点，有助于OA的早期诊断、早期干预治疗和精准靶向治疗，减少晚期骨关节炎给患者带来的痛苦及经济负担。