无溶媒结晶技术在维生素B12生产中的应用

程俊山，李贺，杨继宗，潘丽红，顾晓菲，张苗静

(华北制药河北莱欣药业有限责任公司，河北 石家庄 052165)

维生素B12(vitamin B12)，是一类含钴的复杂有机化合物，是目前已发现的最大、最复杂的维生素分子，其结构性质非常稳定，可溶于水、乙醇和丙酮，因其结晶为红色，故又称红色维生素[1-2]。维生素B12是维持人类生命不可缺少的重要物质，其作用主要是维持正常造血机制；参与人体细胞的代谢，影响DNA的合成与调节，参与脂肪酸的合成和能量的生成[3-6]。维生素B12已被广泛应用于医药、食品和畜牧业，目前中国已成为全球维生素B12的主要产地，因此对其合成过程进行研究具有重要的现实意义。

现阶段工业制造方法均采用微生物发酵法，其生物合成过程比较复杂[7-8]。文献报道的维生素B12为好氧合成路径[9-10]，后提取过程为维生素B12发酵结束后通过加热，将集中在胞内的维生素B12释放到胞外，过滤收集滤液，然后经吸附、解吸、转化、再吸附、再解吸、结晶、重结晶、干燥等步骤得到维生素B12的成品。结晶过程是制药行业重要的环节,结晶技术直接影响成品的质量，所以本文重点研究维生素B12的结晶制备技术。

目前行业内通用的结晶生产工艺是溶媒结晶法，其工作原理是通过向维生素B12料液中加入特定的溶媒相，以降低维生素B12在混合相中的溶解度，使维生素B12结晶体析出的过程。溶媒结晶法技术成熟, 操作较为简单,但主要缺点是生产过程中产生大量含溶媒废液，企业无法自行处理废液，“三废”排放存在超标风险。溶媒使用过程也会造成大气污染问题，其易燃易爆的特性，也给企业生产增加了安全隐患。因此急需开发新的维生素B12结晶工艺，以达到生产、安全、环保、成本等多方面优化的目的。

本文创新性地提出一种无溶媒结晶制备方法，利用响应面分析法优化结晶工艺参数，以维生素B12净化液为原料，通过控制温度、真空度，持续蒸发去除溶剂，再利用温度差使结晶液溶解度下降，得到维生素B12产品，重点是控制减压蒸发使维生素B12在不被破坏的情况下析出晶体。通过去除结晶过程中的溶媒，降低生产与环保成本，提高生产过程的安全性，同时工时、除杂效果满足生产要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；真空旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限公司)。维生素B12净化液取自华北制药河北莱欣药业有限责任公司，其他试剂均为工业级，水为反渗透(reverses osmosis，RO)水。

1.2 无溶媒结晶工艺方法

向结晶罐中加入维生素B12净化液，开启搅拌。将净化液减压升温蒸馏,在蒸馏过程中，分别记录并检测加热至60、65、70、75 ℃，对应真空度分别为0.06、0.07、0.08、0.09 kPa状态时净化液的效价及杂质含量的变化。将浓缩的净化液分别留样，常压冷却温度至10 ℃±1 ℃后，分别将结晶液过滤、干燥，得到的维生素B12晶体成品。

对无溶媒结晶过程中蒸发温度、真空度、结晶前溶液效价等工艺条件进行优化，并进行数据结果比对，以提高主产物质量分数及相关杂质质量分数水平。

1.3 质量分数的检测方法

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

以w(VB12)、最大单杂为考察指标，选取蒸发温度为60、65、70、75 ℃，真空度为0.06、0.07、0.08、0.09 kPa，溶液效价为80 000、85 000、90 000、95 000 μg/mL，进行单因素试验，初步优化制备工艺。

2.1.1 蒸发温度的选择

按照1.2项下方法进行试验，量取维生素B12净化液，真空度控制在0.08 kPa，溶液效价为80 000 μg/mL时，考察了蒸发温度对w(VB12)的变化。由图1可以看出，w(VB12)在蒸发温度增加后先升高再降低，超过65 ℃后w(VB12)下降明显。

图1 蒸发温度对w(VB12)及有关物质指标的影响Fig.1 The effect of evaporation temperature on w(VB12) and related substances

2.1.2 真空度的选择

按照1.2项下方法进行试验，量取维生素B12净化液，蒸发温度为65 ℃、溶液效价为80 000 μg/mL时，考察了真空度对w(VB12)的变化(图2)。由图2得到真空度的增加对有关物质指标的影响不大，但随着真空度的上升，w(VB12)显著提高。

图2 真空度对w(VB12)及有关物质指标的影响Fig.2 The effect of vacuum degree on w(VB12) and related substances

2.1.3 溶液效价的选择

按照1.2项下方法进行试验，量取维生素B12净化液，蒸发温度至65 ℃、真空度为0.09 kPa时，考察了溶液效价对w(VB12)的变化(图3)。由图3可知在溶液效价考察项中，随着效价的增加，w(VB12)先逐渐上升，再缓慢下降。综合上述情况分析，选定蒸发温度62.5～67.5 ℃、真空度为0.08～0.09 kPa、溶液效价为87 500～92 500 μg/mL。在此条件范围内，维生素B12的有关物质指标能达到内控要求，但质量分数变化波动较大，故应用响应面分析法对维生素B12质量分数进一步展开研究。

图3 溶液效价对w(VB12)及有关物质指标的影响Fig.3 The effect of concentration on w(VB12) and related substances

2.2 响应面法优化无溶媒结晶工艺参数

2.2.1 试验设计

根据单因素试验结果，采用Box-Behnken数据模型，选择蒸发温度(A)、真空度(B)和溶液效价(C)为响应面的3个因素，以w(VB12) (Y)为响应值设计试验，其因素水平见表1。

表1 响应面试验的因素及水平

2.2.2 响应面法试验结果

按照表1中因素及水平，无溶媒结晶工艺的响应曲面试验设计方案及试验结果见表2。

表2 响应面试验设计和结果

2.2.3 模型的建立与分析

运用Design-Expert软件对试验结果进行回归拟合，得到w(VB12)(Y)对蒸发温度(A)、真空度(B)、溶液效价(C) 3个因素的二次多项回归拟合方程：

Y=98.38-0.22A+0.21B-0.037C-0.10AB+0.050AC+0.025BC-1.30A2-0.28B2-0.28C2。

表3 响应面回归模型的方差分析

2.2.4 各因素间的交互作用

通过Design-Expert软件分析，绘制回归模型的响应面和等高线，由图4～6可以看出，等高线均为椭圆形，故A、B、C等3个因素两两交互作用显著，对w(VB12)的影响程度由大到小为：AB、AC、BC，结果与回归模型方差分析一致。

图4 蒸发温度和真空度的响应曲面及等高线Fig. 4 Response surface and contour map for evaporation temperature and vacuum degree

图5 蒸发温度和溶液效价的响应曲面及等高线Fig. 5 Response surface and contour map for evaporation temperature and concentration

图6 真空度和溶液效价的响应曲面及等高线Fig.6 Response surface and contour map for vacuum degree and concentration

2.2.5 最佳工艺条件及验证试验

根据二次多项式回归方程得到最佳工艺参数：蒸发温度64.743 ℃、真空度0.087 kPa、溶液效价89 851 μg/mL，在此结晶工艺条件下(具体数据见表4)，w(VB12)的理论值为98.44%。

结合生产实际可操作性，并进一步验证模型方程的适用性与可靠性，最终采用蒸发温度65.0 ℃、真空度0.090 kPa、溶液效价90 000 μg/mL，进行制备维生素B12的无溶媒结晶试验，平行试验3次，结果平均w(VB12)达到98.50%，与理论值误差0.06%，表明响应面分析法所得w(VB12)验证值与回归方程预测值较为吻合，调整后得到的条件依然可靠可行。

表4 验证w(VB12)结果

2.2.6 质量指标

验证应用无溶媒结晶工艺制备的样品(A1～A3)与溶媒结晶工艺制备的样品(B1～B3)进行质量指标对比，具体结果见表5。由数据可以看出，应用无溶媒结晶工艺制备的产品，质量符合生产要求，相较之前溶媒结晶工艺，制备产品的杂质水平略有优势。通过表5各检测项目的相对标准偏差(RSD)值对比，说明新工艺稳定可靠。

表5 不同工艺样品质量检测结果

选取样品A1和B1进一步做稳定性考察试验，设置条件：40 ℃±2 ℃、RH 75%±5%，放置3个月，质量指标结果见表6。由数据可以看出，应用无溶媒结晶工艺制备的产品，相较之前溶媒结晶工艺制备产品的稳定性略好。

表6 不同工艺样品加速试验结果

2.2.7 工业化研究

经稳定性考察试验及风险评估分析后，应用无溶媒结晶工艺进行3批试生产(批重量80～100 kg)，经统计各质量指标均符合行业标准要求(表7)，因此，本文对产业化生产具有指导意义。

表7 试生产产品质量结果

3 结论

本研究利用维生素B12的溶解性的特点，将溶媒析晶改为降温析晶，通过单因素试验，考察蒸发温度、真空度、溶液效价等参数对产品质量的影响，并进一步应用响应面分析法优化无溶媒结晶工艺，优化后工艺条件稳定，制出的成品维生素B12含量高、质量指标较好。无溶媒结晶工艺质量稳定性优于溶媒结晶工艺，经试生产放大后，各质量指标满足企业内控要求，在提高生产安全性的同时，大幅减少了对环境的污染，同时减少了相关工序，有效地降低了生产成本，操作简单，效果明显。该方法为国内首创，技术处行业领先水平，具有极高的工业推广价值。