基于广泛靶向代谢组学的不同颜色棉花花瓣中类黄酮成分差异分析

李秋琳，李燕，陈伟，姚金波，朱守鸿，袁黎，张永山

（中国农业科学院棉花研究所/ 棉花生物学国家重点实验室，河南 安阳 455000）

植物花瓣是花冠的一个重要组成部分，植物花瓣颜色不仅是植物重要的观赏性状之一，而且具有吸引昆虫授粉繁衍后代的功能[1]。 在遗传因素、光照、温度、液泡的pH、植物激素、色素、金属离子含量、植物细胞内环境和花瓣的内部或表层结构（表皮细胞、斑纹）等的影响下，花瓣呈现出各种颜色[2-3]。 植物花瓣颜色的形成受多种代谢产物影响，其中主要有类黄酮、类胡萝卜素、花青素和生物碱等色素[4-5]。

类黄酮属于植物次级代谢产物，是一种多酚物质[6]。根据迈维代谢数据库的分类标准，类黄酮类化合物可以分为10 类：黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷醇类、查耳酮、异黄酮、黄酮醇、花青素（不含糖基的花色苷）、黄酮碳糖苷、二氢异黄酮[7]。其中，查耳酮和橙酮主要控制深黄色花色的形成，黄酮、黄烷醇和黄烷酮类主要控制淡黄色或接近白色的花色形成，花色苷在红、粉红、蓝、紫和紫红色等花瓣颜色的形成中起主要作用[8-9]。在植物生长发育过程中， 类黄酮化合物除了与花、叶、茎、果实和种子的颜色形成相关，还有以下功能：（1）减少紫外线对植物的伤害，如山奈素能吸收紫外线,减少辐射对植物的伤害[10]；（2）作为植物与微生物间的信号分子，如毛地黄黄酮和芹菜苷配基参与豆科植物与根瘤菌发生固氮作用时的信号传导[11-12]；（3）参与调节植物生长素的响应[13]；（4）具有类似外激素的功能，吸引昆虫授粉[14]。此外，类黄酮化合物在医疗保健领域也有广泛的应用价值，据报道多酚类物质能够调节动物体内的氧化应激反应、缓解炎症，黄酮能清除细胞中超氧阴离子自由基、羟基自由基和脂质过氧自由基[15-17]。

棉花是纺织原料——纤维的重要来源。 棉花种类多种多样，花瓣颜色也各有差异，有深红色、红色、水红色、粉色、浅粉色、黄色、粉黄色、橙色、各种中间色以及不同颜色的镶嵌型[18-19]。棉花花瓣颜色既是典型的形态标记，又是重要的遗传分类指标[20]。棉花花瓣内的类黄酮物质具有药用价值[21]。因此，本研究以海7124（H7124，花瓣黄色，属海岛棉，Gossypium barbadenseL.），TM-1（花瓣乳白色，属陆地棉，G. hirsutumL.）和石系亚1 号（花瓣白色，属亚洲棉，G.arboreumL.）3 个材料的花瓣为研究对象，首先测定这3 个材料花瓣中的类黄酮类次级代谢产物，然后利用超高效液相色谱-串联质谱技术Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS对类黄酮进行组分鉴定及定量分析，再结合多元统计分析这3 个棉花材料花瓣中类黄酮类代谢物含量变化情况及其参与的代谢途径，为揭示棉花花瓣中类黄酮物质组成及颜色差异，了解棉花花瓣颜色变化机制及其代谢途径奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集及提取

样品采集：在开花当天，分别摘取海7124 黄色花、TM-1 乳白色花和石系亚1 号白色花约20朵，放冰盒遮光保存立即带回室内，将去除花基斑部分的花瓣（同时避免沾染花粉）保存于20 mL离心管再放置于液氮中冷冻（每份样品约5 g，分别取3 个生物学重复）， 最后置于－80 ℃超低温冰箱保存备用。

类黄酮提取：（1） 将3 组样品放置于冻干机（Scientz-100F）中真空冷冻干燥；（2）利用研磨仪（MM 400，Retsch）研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末状；（3）称取100 mg 的粉末，溶解于1.2 mL 70%（体积分数）甲醇提取液中；（4）每30 min 将样品混合液涡旋一次，持续30 s，重复涡旋6 次，然后将样品混合液置于4 ℃冰箱过夜；（5）将样品离心（转速12 000 r·min－1，10 min）后，吸取上清液，用微孔滤膜（孔径0.22 μm）过滤上清液，并保存于进样瓶中，用于LC-MS/MS[22]分析。

1.2 样品测定

类黄酮类代谢物检测的液相条件主要包括：（1） 色谱柱：Agilent SB-C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm。（2）流动相：A 相为超纯水（加入0.1%的甲酸），B 相为乙腈（加入0.1%的甲酸）。 （3）洗脱梯度：0.00 min B 相比例为5%；9.00 min 内B 相比例线性增加到95%， 并在95%维持1 min；10.00－11.10 min，B 相比例降为5%，并以5%平衡至14.00 min；（4）流速0.35 mL·min－1；柱温40 ℃；进样量4 μL。

类黄酮类代谢物检测是在三重四极杆线性离子阱质谱仪（Q TRAP），AB4500 Q TRAP UPLCMS/MS 系统上获得的，该系统配备了ESI Turbo离子喷雾接口，可由Analyst 1.6.3 软件（AB Sciex）控制运行正负两种离子模式。 电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI） 操作参数如下：离子源，涡轮喷雾；源温度550 ℃；离子喷雾电压（IS）5 500 V（正离子模式）/－4 500 V（负离子模式）；离子源气体I（GSI），气体II（GSII）和帘气（Curtain gas,CUR）分别设置为50、60 和25 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。在三重四级杆（Triple quadrupole,QQQ）和线性离子阱（Linear ion trap,LIT） 模式下分别用10 μmol·L－1和100 μmol·L－1聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。 QQQ扫描使用三重四级杆质谱的多反应监测模式（Multiple reaction monitoring，MRM）， 并将碰撞气体（氮气）设置为中等。 通过进一步对去簇电压（Declustering potential，DP） 和碰撞能（Collision energy，CE） 优化， 完成了各个MRM 离子对的DP 和CE。 根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测一组特定的MRM 离子对。

1.3 质控样本

质控样本（Quality control samples，QC）由3组不同棉花材料的花瓣样本提取物等量混合制备而成，设3 个重复。在质谱检测的过程中，每10个样本间插入1 个质控样本，以监测分析过程的重复性。

1.4 数据分析

使用迈维代谢 （武汉） 生物技术有限公司UPLC-MS/MS 检测平台[7]，利用软件Analyst 1.6.3[23]进行质谱定性定量分析，包括基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和质谱碎片归属分析等。 采用无监督模式识别的主成分分析（Principal component analysis，PCA）、有监督模式识别的偏最小二乘判别分析（Partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）等方法，对各组样本之间的总体代谢物和组内样本代谢物进行多元统计分析[24]，研究3 个棉花材料花瓣之间的类黄酮类代谢产物的差异， 再利用KEGG 网站（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）[25]和MB Role 网站（http://csbg.cnb.csic.es/mbrole/）[26]进行通路富集分析。 差异代谢物的筛选标准：（1）变量权重值（Variable importance in projection，VIP），VIP＞1；（2）显著性阈值，P＜0.05；（3）差异倍数（Fold change，FC），经log2转化，log2FC≥1 或log2FC≤－1。

2 结果与分析

2.1 样品质量控制及统计分析

海岛棉海7124、陆地棉TM-1 和亚洲棉石系亚1 号3 个材料的花瓣如图1 所示，将3 个样品及混合样品的类黄酮类代谢物进行主成分分析（PCA），初步了解各组样本之间的总体代谢物差异和组内样本之间的变异度大小。PCA 结果显示4 组样本之间类黄酮类代谢物呈分离趋势， 组间呈聚集趋势。 由图2 可以看出， 主要成分PC1、PC2、PC3 对差异的贡献率分别是54.51%、36.34%、4.98%。这表明不同颜色花瓣样品的类黄酮类代谢物存在明显差异。 对花瓣样品中检测到的类黄酮类代谢物数据进行归纳总结分析， 对3个样本进行分组（黄色/ 乳白色、乳白色/ 白色和黄色/ 白色）比较，建立PLS-DA、OPLS-DA 模型进行分析（表1）。 PLS-DA 及OPLS-DA 模型的R2和Q2越接近于1 时表示模型越稳定可靠。 对黄色/乳白色、乳白色/白色和黄色/白色3 组样品的PLS-DA 和OPLS-DA 模型进行200 次排列验证， 结果显示R2、Q2接近1，P值均小于0.05，表明3 个棉花花瓣样本含有的类黄酮类代谢物的种类与含量存在明显差异。

表1 样本分组比较的R2 和Q2Table 1 The calculated R2 and Q2 values of different groups

图1 3 个棉花材料表型性状图Fig. 1 The phenotypic traits of flower of three cotton materials

图2 3 组样本与质控样本质谱数据的PCA 结果Fig. 2 PCA results of three groups of samples and quality control

2.2 代谢物分析

基于迈维代谢（武汉）自建代谢物数据库及相关质谱数据库，对黄色、乳白色和白色花瓣的类黄酮类代谢物进行质谱定性定量分析。 3 组样本中共鉴定到10 类184 种类黄酮类代谢物，其中76 种属于黄酮醇类（41.30%），51 种属于黄酮类（27.72%），12 种花青素类代谢物，11 种二氢黄酮类代谢物，11 种黄烷醇类代谢物，10 种二氢黄酮醇类代谢物，4 种查耳酮类代谢物，4 种黄酮碳糖苷类代谢物，4 种异黄酮类代谢物，1 种二氢异黄酮类代谢物。 对所检测花瓣样品及代谢物进行聚类分析发现，3 种材料花瓣中的类黄酮积累模式存在显著差异（图3）。

图3 全部样品含有的类黄酮类代谢物聚类热图Fig. 3 Heatmap of flavonoid metabolites content in all samples

2.3 差异代谢物筛选分析

为了解3 个颜色花瓣中类黄酮类代谢物的组成差异情况，利用单维分析t检验（P＜0.05）和多维分析OPLS-DA 的VIP 值（VIP＞1）筛选各组间的差异代谢物。 如差异代谢物火山图（图4）所示，3 个颜色的花瓣之间共存在171 种差异代谢物。 黄色与乳白色花瓣相比存在的差异代谢物有121 种， 其中黄色花瓣中相对含量增加的类黄酮类代谢物共有32 种， 相对含量减少的代谢物89种； 乳白色与白色花瓣比较发现差异代谢物140种，其中乳白色花瓣中相对含量增加的代谢物98种，相对含量减少的有42 种；黄色/ 白色比较组存在有128 种差异代谢物， 黄色花瓣中72 种相对含量增加，56 种相对含量减少。 我们将3 组间差异代谢物的差异倍数进行log2处理，绘制了差异倍数图，并列出差异倍数排在前20（相对含量增加和减少各10 个）的代谢物（附表1～3）。 其中，黄色/乳白色比较组中差异倍数前20 的代谢物包括黄酮醇类7 种， 黄酮类6 种， 黄烷醇类2种， 查耳酮类2 种， 花青素类1 种， 异黄酮类1种，二氢异黄酮类1 种。乳白色/白色比较组中差异倍数前20 的代谢物有12 种为黄酮醇类，3 种为黄酮类，2 种为黄烷酮类，异黄酮类1 种，二氢异黄酮类1 种，花青素类1 种。黄色/白色比较组中差异倍数前20 的代谢物分别是： 黄酮醇类9种， 黄酮类5 种， 二氢黄酮类2 种， 花青素类1种，黄烷醇类1 种，二氢黄酮醇类1 种，查耳酮类1 种。

图4 差异代谢物火山图Fig. 4 Volcano plot of differentially expressed metabolites

为了研究在不同分组中相对含量变化呈升高和降低趋势的类黄酮类代谢物，将每组中差异代谢物相对含量的平均值进行z-score 标准化，然后进行K均值（K-means）聚类分析（图5），在花瓣由黄色至乳白色至白色变化中（表2），15 种呈升高趋势的代谢物有黄酮醇类（7 种）、黄酮类（4 种），黄烷醇类（1 种），二氢黄酮（1 种）和二氢黄酮醇（1 种）；15 种呈降低趋势的代谢物有黄酮醇（9 种），黄酮类（3 种），查耳酮类（1 种），二氢黄酮醇类（1 种）和花青素类（1 种）。 在花瓣颜色由黄至白的变化中，黄酮醇和黄酮类物质含量有的升高有的降低，只有查耳酮类的异杞柳苷含量呈下降趋势，推测异杞柳苷可能与棉花黄色花瓣的颜色形成相关。

表2 黄色至乳白色至白色花瓣中升高或降低的差异代谢物Table 2 The list of metabolites that increases or decreases from yellow to milky white to white petal

图5 差异代谢物K-means 图Fig. 5 K-means diagram of different metabolites

2.4 差异代谢物KEGG 功能注释及富集分析

我们利用KEGG 和MB Role 网站对差异代谢物涉及的代谢途径进行通路富集分析，发现有114 种差异代谢物能被注释到数据库现有的通路，且主要富集在6 个通路上，分别是代谢途径、类黄酮的生物合成、异黄酮的生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成、花青素的生物合成和次级代谢产物的生物合成（图6）。 这些差异代谢物参与1 个或多个代谢通路。 如：表阿夫儿茶精、表没食子儿茶素、儿茶素、二氢杨梅素、根皮苷、根皮素和没食子儿茶素均参与了类黄酮生物合成和次级代谢产物的生物合成； 山奈酚-3-O- 葡萄糖苷（紫云英苷）和山奈酚-3-O- 芸香糖苷均参与了黄酮和黄酮醇的生物合成和次级代谢产物的生物合成；表儿茶素、二氢槲皮素、圣草酚、香橙素均参与了类黄酮的生物合成、代谢和次级代谢产物的生物合成；槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷（芦丁）均参与了黄酮和黄酮醇的生物合成、 代谢途径和次级代谢产物的生物合成；飞燕草素参与类黄酮的生物合成、花青素的生物合成和次级代谢产物的生物合成；杨梅素参与了类黄酮的生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成和次级代谢产物的生物合成；槲皮素、木犀草素和山奈酚均参与了类黄酮的生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成、代谢途径和次级代谢产物的生物合成；柚皮素参与类黄酮的生物合成、异黄酮的生物合成、 代谢途径和次级代谢产物的生物合成。黄色/乳白色比较组间的差异代谢物在黄酮和黄酮醇的生物合成途径上显著富集，包括14 种代谢物。 乳白色/ 白色比较组间的差异代谢物显著富集的代谢通路是类黄酮的生物合成。 黄色/ 白色组的差异代谢物在花青素合成途径富集最显著，在类黄酮生物合成中富集数量最多，有20 种。 这些差异代谢物参与的代谢途径可能参与黄色、乳白色和白色花瓣颜色的形成。

图6 3 组差异代谢物KEGG 富集通路Fig. 6 Enriched KEGG pathways of differentially expressed metabolites in three groups

我们对在黄色到乳白色到白色花瓣中相对含量变化呈上升趋势和下降趋势的类黄酮类代谢物也进行了富集分析，结果显示，随着花瓣颜色变化（从黄色到白色），3 种材料中相对含量呈上升趋势的15 种代谢物中， 有5 种被注释到代谢途径上（图7），分别是香橙素、表儿茶素、金圣草黄素、 山奈酚-3-O- 葡萄糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷。 其中后3 种代谢物均参与黄酮和黄酮醇的生物合成途径，前2 种代谢物均参与类黄酮的生物合成途径。 有研究表明查耳酮可调控花瓣深黄色的形成[8-9]，在黄色、乳白色、白色棉花花瓣中， 异杞柳苷含量逐步下降， 推测异杞柳苷与3种材料花瓣的颜色差异相关， 异杞柳苷参与的代谢途径可能与棉花花瓣的黄色形成机制密切相关。

图7 差异代谢物KEGG 富集通路Fig. 7 Enriched KEGG pathways of differentially expressed metabolite

3 讨论

类黄酮化合物是植物体中的一类较大的次级代谢物类群，其生物合成途径的调控也是人们研究的重点[27]。植物的类黄酮合成途径受许多转录因子的调控，如MYB[28]、bHLH[29]、WD40[30]和NAC[31]以及其他转录因子。 拟南芥AtMYBL2编码R3-MYB 相关蛋白， 参与类黄酮生物合成的调控[32]；MYB21 直接与FLS1启动子中的GARE顺式元件结合来调节黄酮醇的生物合成[33]。钝鳞紫背苔的bHLH 家族蛋白PabHHL1 在拟南芥中异源表达时，能激活黄酮类化合物和花青素的合成，并参与上调黄酮类化合物合成上游和下游的结构基因的表达[34]。 研究发现花瓣的黄色一般与橙酮和查耳酮有关，橙酮在波斯菊、金鸡菊和金鱼草等的观赏花卉上呈现亮黄色[35]；查耳酮是菊科大丽属和石竹科石竹属的黄色色素[36]；香石竹花瓣的黄色与查耳酮2′- 葡萄糖苷的合成和积累有关[37]。 我们对差异代谢物的K-means 分析中发现查耳酮类物质在黄色至白色花瓣中呈下降趋势，推测可能是查耳酮类物质对花瓣黄色的形成具有重要作用。 本研究虽然明确了黄色、乳白色和白色棉花花瓣材料中的主要类黄酮类色素成分，但因花瓣颜色调控的复杂性，未来可以结合转录组数据进行类黄酮生物合成途径上相关基因的分析，深入研究棉花花瓣颜色的形成机制。

类黄酮类化合物结构复杂、种类多样，对人体健康有许多益处，具有镇痛、护肝、抗心律失常、抗自由基、抗脑缺血损伤、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学活性和药理作用[38-41]。 以往研究发现在棉花花瓣中提取出的总黄酮物质能有效改善小鼠的记忆障碍[42]。芦丁、橙皮素和槲皮素等具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、保护心血管和心脏等功能[43-48]。 本研究中棉花黄色、乳白色、白色花瓣中均积累了较多的类黄酮物质，表明花瓣中的类黄酮类次生代谢物具有可利用的价值。

4 结论

本研究采用广泛靶向代谢组学技术，以3 种棉花材料（海岛棉H7124、陆地棉TM-1 和亚洲棉石系亚1 号）的花瓣为研究对象，对花瓣中检测到的类黄酮类代谢物进行对比分析，共鉴定得到10 类184 种类黄酮类代谢物， 其中差异代谢物171 种，占所有代谢物的92.94%。 通过功能注释和差异代谢物富集分析，发现这些差异代谢物主要参与黄酮和黄酮醇的生物合成，以及类黄酮的生物合成途径，这2 条途径可能是黄色、乳白色和白色棉花花瓣之间差异代谢物形成的主要途径。 其中，查耳酮类物质异杞柳苷在黄色、乳白色、白色花瓣中的含量逐步减少，推测该物质与棉花花瓣黄色的形成相关。 本研究不仅为棉花不同颜色花瓣中类黄酮类代谢物的利用奠定基础，并且为棉花花瓣的颜色形成机制及相关代谢途径研究提供重要理论依据。

附表：

详见本刊网站（http://journal.cricaas.com.cn）本文网页版。

附表1 黄色/ 乳白色比较组中差异倍数在前20 的代谢物

Table S1 Top 20 differentially expressed metabolites in the comparison group of yellow/milky white petal

附表2 乳白色/ 白色比较组中差异倍数在前20 的代谢物

Table S2 Top 20 differentially expressed metabolites in the comparison group of milky white/white petal

附表3 黄色/白色比较组中差异倍数前20 的代谢物

Table S3 Top 20 differentially expressed metabolites in the comparison group of yellow/white petal