陆地棉纤维起始期优势表达基因GhCRPK1 的克隆及功能研究

王雪慧，陈丽锦，赵若林，程海亮，张友平，王巧连，吕丽敏，宋国立，左东云

（中国农业科学院棉花研究所/ 棉花生物学国家重点实验室，河南 安阳 455000）

关键字：类受体激酶；GhCRPK1；纤维发育；表皮毛；信号传导

植物类受体激酶（Receptor like kinase，RLK）是一类跨膜受体蛋白， 通常具有胞外结构域、跨膜结构域及胞内的激酶结构域。 胞外结构域可以感知细胞外或环境中的信号分子，跨膜结构域将受体激酶镶嵌到细胞膜上，胞内激酶结构域具有丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点， 能将底物磷酸化传递信号。 植物中RLKs 的胞内激酶结构域具有较高的同源性， 但是胞外结构域具有较大的差异。根据胞外结构域的序列特点，可以将RLKs 分为亮氨酸重复序列（Leucine rich-repeat，LRR）受体激酶、凝集素（Lectin）受体蛋白、表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）受体蛋白、细胞壁偶联受体激酶 （Wall-associated kinase，WAK）及受体类细胞质激酶（Receptor-like cytoplasmic kinase，RLCK）等[1]。 RLCK 没有胞外结构域只含有胞内激酶结构域，一般通过与其它RLKs 相互作用进行信号传递。

研究表明，受体激酶RLKs 在植物的生长发育及防御反应中发挥着重要的作用。 FLS2（Flagellin-sensitive 2） 能够识别细菌的鞭毛蛋白N 末端的22 个氨基酸，激发拟南芥的免疫反应，提高拟南芥对细菌的抗性[2-4]。延伸因子EF-Tu 受体（EFTu receptor，EFR） 能识别细菌的延伸因子EF-Tu（Elongation factor thermo unstable），增强拟南芥对农杆菌的抗性[5]。 拟南芥BRI1（Brassinosteroid insensitive 1） 能够识别油菜素内酯（Brassinos teroids，BRs），然后激活BR 信号通路[6-7]。 CLAVATA1 是1 个在分生组织中表达的LRR 类受体激酶， 识别CLAVATA3 短肽信号分子后， 抑制WUSCHEL（WUS）基因表达，调控分生组织的形成[8-9]。 FER（FERONIA）是1 个长春花类受体激酶（Catharanthus roseusRLK1，CrRLK1）蛋白，其对应的信号分子是RALF （Rapid alkalinization factor），调控植物根的发育及花粉的生长[10-13]。 此外，ANX1（ANXUR1）、ANX2（ANXUR1）、BUPS1（Buddha’s Paper Seal l）、BUPS2（Buddha’s Paper Seal 2）及LRX（Leucine rich-repeat extensin） 能够识别RALF 家族的其他成员进而调控花粉管的生长及花粉管与卵细胞的识别[14-18]。RLKs 参与植物生长发育及抗逆反应的各方面，是胞外信号与胞内应答反应的桥梁，是植物响应各种环境信号的重要组成部分。

棉花是最重要的天然纤维的来源，在我国国民经济中占有举足轻重的地位。陆地棉（Gosspium hirsutum）是主要的棉花栽培品种，产量高、适应性广，占棉花总产的95%以上。 尽管在拟南芥和水稻等植物中鉴定了部分RLKs 的生物学功能，但是RLKs 在棉花中的功能研究较少，特别是参与棉花纤维发育的机制知之甚少。 本研究基于陆地棉全基因组关联分析的最新数据[19]，并利用荧光定量聚合酶链式反应 （Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）的方法筛选到在棉花纤维发育起始期优势表达的基因GhCRPK1，推测该基因可能参与了棉花纤维发育的起始， 在拟南芥中验证了该基因的分子功能，并利用酵母双杂交的方法筛选了与这个基因相互作用的蛋白，为揭示RLKs 调控棉花纤维发育的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1试验材料

试验所用的棉花材料陆地棉遗传标准系TM-1、拟南芥哥伦比亚野生型（Col-0）、本氏烟草均由本课题组保存，拟南芥突变体cpk1-1（SALK_004253C）和cpk1-2（SALK_054771）由中国农业大学杨淑华教授馈赠。 大肠杆菌DH5ɑ 和农杆菌GV3101 购自上海唯地生物技术有限公司；PCR扩增采用南京诺唯赞生物科技有限公司的高保真酶2×PhantaMax Master Mix；RNA 提取使用天根生化有限公司的多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒；cDNA 反转录采用宝生物的PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒；qRT-PCR 分析使用Genstar 公司的2×RealStar Green Fast Mixture（with ROX II）；同源重组采用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpressUltra One Step Cloning Kit 试剂盒。

1.2 试验方法

1.2.1取样、RNA 提取、逆转录和荧光定量分析。陆地棉标准系TM-1 种植在中国农业科学院棉花研究所老所部农场（河南省安阳县白璧镇），在开花当天挂牌标记，分别采集开花前5 d（－5 days post anthesis，－5 DPA），开花前3 d（－3 DPA）、开花前1 d（－1 DPA）、开花当天（0 DPA）、开花后1 d（1 DPA）、开花后3 d（3 DPA）、开花后5 d（5 DPA）、开花后7 d（7 DPA）和开花后10 d（10 DPA） 的棉铃， 其中10 DPA 的棉铃拨取纤维、 其他时期取的是胚珠和纤维的混合物。 在ABI QuantStudio 3 实时定量PCR 仪上进行qRT-PCR 分析，所有操作均严格按照试剂盒使用说明进行。 内参基因为Histone 3，所有基因的引物见附表1。 qRT-PCR 反应体积为20 μL，扩增程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸20 s， 采集荧光，40 个循环后绘制熔解曲线。

1.2.2GhCRPK1 基因克隆。 根据GhCRPK1基因的序列信息， 设计引物GhCRPK1PF1/GhCRPK1PR1（附表1），以TM-1 的cDNA 为模板扩增GhCRPK1基因，将PCR 产物切胶回收克隆到pCE-Zero 载体上， 转化大肠杆菌DH5ɑ 感受态，挑选阳性克隆，送往上海生工生物技术有限公司测序。

1.2.3生物信息学分析。 从Cotton FGD 网站（https://cottonfgd.org/）获取Gh_A10G1849 的基因序列和蛋白质序列， 并以Gh_A10G1849 的蛋白序列作为查询序列搜索并下载海岛棉、亚洲棉和雷蒙德氏棉中的同源蛋白序列；同时在植物基因组网站（http://ensemblgenomes.org/）通过BLASTP搜索并下载番茄、拟南芥、水稻、小麦、玉米等物种中的同源蛋白序列，在各物种中选择同源性最高的1～2 个蛋白进行蛋白保守性分析和进化树分析。 使用ClustalX[20]软件进行蛋白多序列比对分析，用MEGAX[21]软件构建系统进化树。

1.2.4亚细胞定位分析。 在GhCRPK1编码序列前端和末端分别添加SalI 和BamHI 酶切位点，在GFP序列前端和末端分别添加BamHI 和EcoRI 酶切位点，扩增引物为GhCRPK1PF2/GhCRPK1PR2 （附表1）。 通过同源重组构建pCaMV35S∷GhCRPK1-GFP 载体， 测序结果比对正确后转化到农杆菌菌株GV3101，注射生长1 月左右的烟草幼嫩叶片。黑暗条件下室温处理2 d 后，在激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP8）下观察荧光。

1.2.5拟南芥过表达及表皮毛观察。 PCR 扩增GhCRPK1基因的编码区， 扩增引物为GhCRPK1PF3/GhCRPK1PR3（附表1），通过同源重组构建GhCRPK1过表达载体pCaMV35S::GhCRPK1-His。 载体测序结果比对正确后转化到农杆菌菌株GV3101，利用浸花法转化拟南芥[22]，并在含有50 ng·mL－1卡那霉素的MS 培养基中筛选阳性植株。 选取4 周大小的拟南芥植株莲座叶， 在无水乙醇中脱色2 h 后， 在体式显微镜（Olympus SZX10） 下观察拟南芥表皮的形态，按照参考文献[19]中的方法统计拟南芥表皮毛的长度和密度。

1.2.6酵母双杂交文库筛选及互作蛋白点对点验证。 将GhCRPK1基因的编码序列插入到pGBKT7 载体中，筛选陆地棉纤维发育起始时期的酵母表达文库。 将筛选到的阳性克隆测序后从陆地棉中克隆其编码序列构建到pGADT7 载体中，与pGBKT7-GhCRPK1 进行点对点的互作验证。 将筛选得到的Gh_D08G0057 编码序列连接到pGADT7 载体中，分别将pGBKT7-GhCRPK1和pGADT7-T 质粒（对照）及pGBKT7-GhCRPK1和pGADT7-Gh_D08G0057 质粒共转化酵母，分别在二缺培养基 （无亮氨酸和色氨酸，即SD/-Leu/-Trp，SD-DDO）和添加α- 半乳糖苷酶显色底物（X-α-gal）、抗生素金担子素A（Aureobasidin A，AbA）的四缺培养基（无亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤， 即SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade，SD-QDO）中生长。所有操作均严格按照Clontech公司的MatchmakerGold Yeast Two-Hybrid System 说明进行。

2 结果与分析

2.1 与棉花纤维发育相关的受体激酶基因的筛选

为了筛选陆地棉中与纤维发育相关的受体激酶，利用陆地棉全基因组关联分析数据，筛选到34 个与棉花纤维长度、 强度和衣分相关的受体激酶候选基因，这些基因可能在棉花纤维发育过程中发挥着重要的作用。 利用qRT-PCR 分析这34 个基因在棉花纤维发育不同时期的表达量发现， 其中18 个基因在棉花纤维发育过程中的表达具有一定的规律（图1），而其他基因在棉花纤维发育过程中的表达没有明显规律。 这18 个基因在纤维发育过程中具有不同的表达模式：部分基因如Gh_D08G2087、Gh_A13G2073、Gh_A08G2425、Gh_D02G0129、Gh_A06G1068、Gh_A08G0809、Gh_A09G0625、Gh_A10G1831、Gh_A08G2273、Gh_A01G0896、Gh_D13G2124和Gh_D08G00480在开花后5 d、7 d 或10 d 优势表达（图1A）；部分基因Gh_A10G0312、Gh_A09G0186和Gh_A08G0234 的表达量在开花前较高， 在开花后降低（图1B）；部分基因在棉花纤维发育的起始时期表达水平较高， 如Gh_A10G1849在开花当天及开花后1 d 和3 d 表达水平高，Gh_D05G3666在开花前1 d 表达水平最高，Gh_A09G0177在开花后1 d 表达水平最高（图1C）。Gh_A10G1849、Gh_A09G0177和Gh_D05G3666三个基因在纤维发育起始时期高水平表达，表明其可能参与了棉花纤维发育起始， 特别是Gh_A10G1849在开花当天到开花后3 d 持续高水平表达， 与棉花纤维发育起始的时期一致，推测其在棉花纤维发育起始过程中发挥着重要的作用。

图1 18 个受体激酶基因在棉花纤维发育不同时期的表达模式分析Fig. 1 Expression patterns of 18 receptor kinase genes at different stages of cotton in fiber development

2.2 Gh_A10G1849 基因的克隆及生物信息学分析

在CottonFGD 数据库中搜索Gh_A10G1849基因，发现该基因的全长为4 594 bp，包含有1 个1 047 bp 的开放阅读框， 编码348 个氨基酸，预测蛋白的分子量为39.11 KDa， 等电点为7.34。在TM-1 中克隆该基因完整的编码序列， 经过测序比对， 与数据库中Gh_A10G1849基因的序列完全一致。 对该基因进行功能注释发现其与拟南芥冷响应蛋白激酶1 （Cold-responsive protein kinase 1，CRPK1） 编码基因At1g16670同源性较高，因此将该基因命名为GhCRPK1。 CRPK1 属于RLK 家族中的RLCK 亚家族， 无胞外结构域和跨膜结构域。 同源蛋白序列分析发现，CRPK1在二倍体棉花雷蒙德氏棉和亚洲棉、四倍体棉花陆地棉和海岛棉中均存在，并且广泛存在于拟南芥、番茄和可可等双子叶植物及水稻、玉米和小麦等单子叶植物中， 表明CRPK1 可能在植物中发挥重要的作用。

比较陆地棉中的GhCRPK1 与海岛棉（G.barbadense）、亚洲棉（G. arboreum）、雷蒙德氏棉（G.raimondii）、 可可（Theobroma cacao）、 番茄（Solanum lycopersicum）、 拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）和小麦（Triticum aestivum）中的CRPK1 的蛋白序列，尽管存在一定的差异，但是它们发挥功能的激酶结构域都是高度保守的（图2）。 进一步分析这些物种中的CRPK1 蛋白的进化关系发现 （图3），CRPK1 蛋白在进化上也具有保守性， 棉花中来源于A 基因（亚）组的CRPK1 蛋白聚在一类，而来源于D 基因（亚） 组的CRPK1 蛋白聚在一类； 棉花中6 个CRPK1 蛋白与棉花近源种可可（Tc10v2_t005900） 及番茄 （Solyc09g007730）中CRPK1 蛋白聚在一类，而禾本科植物水稻、小麦和玉米中的CRPK1 分别聚在一起。 这些结果说明CRPK1 蛋白在进化上高度保守， 推测其在植物的生长发育中发挥着广泛而重要的作用。

图2 多序列比对分析CRPK1 蛋白的保守结构域Fig. 2 Multiple sequence alignment of CRPK1 with its homologs and conserved domains analysis

图3 GhCRPK1 蛋白与其同源蛋白的系统进化分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of GhCRPK1 protein and its homologs from 9 species

2.3 GhCRPK1 蛋白的亚细胞定位分析

GhCRPK1 蛋白属于RLK 家族中的RLCK亚家族，一般定位在细胞膜。 为了确定GhCRPK1蛋白在细胞中的定位情况， 在烟草中观察融合蛋白的荧光分布， 对照组pCaMV35S∷GFP 载体的荧光信号分布在细胞膜和细胞核中，而融合蛋白载体pCaMV35S∷GhCRPK1-GFP 的荧光信号只分布在细胞膜上（图4），说明GhCRPK1 与传统的受体激酶类似，是一个膜定位蛋白。

图4 GhCRPK1 蛋白的亚细胞亚定位Fig. 4 Subcellular location of GhCRPK1

2.4 GhCRPK1 基因的功能分析

为了进一步研究GhCRPK1基因的功能，构建pCaMV35S∷GhCRPK1-His 过表达载体，并转化到拟南芥中， 得到稳定表达GhCRPK1-His 的T3代转基因拟南芥植株。在体式显微镜下观察野生型（Wild type，WT）拟南芥、过表达GhCRPK1-His 拟南芥及拟南芥crpk1突变体莲座叶的表皮毛长度（图5）。通过观察和统计发现，野生型拟南芥的表皮毛平均长度为282.40 μm， 过表达GhCRPK1拟南芥的表皮毛的平均长度为340.60 μm， 而crpk1突变体的表皮毛的平均长度为263.60 μm（表1）。表明过表达GhCRPK1基因可促进拟南芥表皮毛的伸长； 拟南芥CRPK1基因突变会抑制拟南芥表皮毛的生长，导致表皮毛变短（图5）。 同时观察了3 个材料莲座叶表皮毛的密度，发现3 种材料表皮毛的密度没有显著差异（表1）。 这些结果说明，GhCRPK1正向调控拟南芥表皮毛的伸长，而不影响拟南芥表皮毛的密度。

表1 拟南芥莲座叶表皮毛长度和密度Table 1 The trichome length and density of rosette leaf in transgenic Arabidopsis

图5 野生型和转基因拟南芥表皮毛的表型Fig. 5 Phenotype of of trichomes in wild type and transgenic Arabidopsis

为了进一步分析GhCRPK1 蛋白发挥功能的分子机制，以GhCRPK1 为诱饵，在棉花纤维发育起始时期的蛋白表达文库中筛选到1 个与GhCRPK1 相互作用的蛋白，对应基因为Gh_D08G0057。功能注释发现，Gh_D08G0057基因属于HSP90 家族。 为了确定GhCRPK1 与Gh_D08G0057 的互作关系，我们在酵母中进行了点对点的互作验证，首先在酵母中对pGADT7-Gh_D08G0057 载体进行转录自激活检测， 发现Gh_D08G0057 蛋白在酵母中没有转录自激活活性；分别将pGADT7-Gh_D08G0057 和pGBKT7-GhCRPK1 共转化酵母后，发现只有pGBKT7-GhCRPK1 和pGADT7-Gh_D08G0057 质粒共转化的酵母能够在四缺培养基中长出菌斑（图6），说明GhCRPK1 与Gh_D08G0057 蛋白在酵母中能够发生相互作用。

图6 GhCRPK1 与Gh_D08G0057 蛋白在酵母中互作分析Fig. 6 Yeast two-hybrid interaction analysis of GhCRPK1 and Gh_D08G0057

3 讨论

CRPK1 是1 个冷响应蛋白激酶，属于类受体蛋白激酶。在拟南芥中，CRPK1 蛋白位于细胞膜，接收到外界环境传来的低温信号时，激酶活性被激活进而磷酸化14-3-3s 蛋白，促使14-3-3s 在细胞核中的积累， 进而调控低温相关转录因子CBF1 和CBF3 的蛋白活性水平， 激活下游冷响应相关基因的表达，调控植物对低温的响应[23-26]。但是拟南芥CRPK1 缺少典型的跨膜结构域，无法直接识别胞外信号， 因此CRPK1 识别胞外冷信号需要其它蛋白的协助。 拟南芥热激蛋白HSP90 也参与细胞冷胁迫反应介导的细胞死亡及防御反应[27]。热激蛋白在代谢较快、蛋白质大量合成的细胞中含量较多，具有稳定蛋白质或辅助蛋白质完成折叠的作用，在蛋白质复合物组装过程中保护蛋白质并防止蛋白质聚集和分解，同时对错误折叠的蛋白质进行降解[28]。 通过棉花全基因组关联分析数据， 在4 个环境中均能检测到GhCRPK1与纤维长度高度相关，并且GhCRPK1在开花当天、开花后1 d 和3 d 均高水平表达，与棉花纤维发育起始时期一致， 说明GhCRPK1可能参与了棉花纤维发育的起始。 将该基因导入拟南芥中过量表达后，能显著增加拟南芥表皮毛的长度，而拟南芥中的crpk1突变体的表皮毛变短，拟南芥的表皮毛和棉花纤维发育有着相似之处，表明GhCRPK1 在棉花纤维发育过程中发挥着重要的作用。 此外酵母双杂交试验表明GhCRPK1与热激蛋白Gh_D08G0057 相互作用， 可能参与表皮毛的调控。 陆地棉中的GhCRPK1 与拟南芥中的CRPK1 蛋白具有较高的同源性， 它们均没有明显的跨膜结构域，但均定位在细胞膜上发挥作用。 推测在棉花纤维发育过程中，由细胞表面的特定受体识别到环境中信号分子， 激活GhCRPK1 的激酶活性，进而诱发纤维发育或表皮毛发育相关基因的表达， 促进纤维或表皮毛的伸长。Gh_D08G0057 与GhCRPK1 相互作用，可能是辅助GhCRPK1 折叠形成正确的空间构象， 调节GhCRPK1 在细胞膜上的激酶活性以发挥功能。

4 结论

本研究克隆了陆地棉的受体激酶基因GhCRPK1，该基因广泛存在于高等植物中，其激酶结构域在不同的物种中同源性较高， 推测CRPK1 在不同的植物中具有相似的功能。 亚细胞定位发现GhCRPK1 定位在细胞膜上， 在拟南芥中稳定表达GhCRPK1基因能促进拟南芥表皮毛的伸长， 而拟南芥中的同源基因突变体crpk1表皮毛变短。 酵母双杂交试验表明GhCRPK1 与热激蛋白Gh_D08G0057 相互作用。 本文发现GhCRPK1 在调控拟南芥表皮毛发育过程中发挥着重要的作用，为探究其调控棉花纤维发育的功能提供了理论基础。

附表：

详见本刊网站（http://journal.cricaas.com.cn）本文网页版。

附表1 本研究中所用到的引物序列

Table S1 The sequence of primers used in this study