长期施肥棕壤有机硫矿化特征及其驱动力

韩 萌，杨劲峰*，谢 芳，李 娜，戴 健，王 月，鲁 豫，韩晓日*

（1 沈阳农业大学土地与环境学院/土壤肥料资源高效利用国家工程实验室/农业农村部东北玉米营养与科学观测实验站，辽宁沈阳 110866；2 鹤岗市农业综合服务中心，黑龙江鹤岗 154101）

硫是所有植物生长发育不可缺少的营养元素之一，其含量影响着土壤中各种生物化学反应以及植物的正常生长发育[1]。表层土壤中的硫大部分以有机硫的形态存在，无机硫占的比例很小，而多数有机硫必须矿化为SO42–的形态才能被作物吸收利用[2]。有机硫可以分为碳键硫、酯键硫以及未知态硫，碳键硫和酯键硫对植物是有效的，且对当季作物来说，碳键硫的有效性低于酯键硫，未知态硫对植物的有效性还不明确[3-6]。也有研究表明，土壤有机硫含量影响着土壤有效硫的有效性，植物吸收的土壤有机硫占其吸收所有土壤硫的45%[7-8]。因此有机硫是土壤中硫的重要组成部分之一，其有效性评价与土壤微生物活动和生物化学转化过程以及土壤硫元素循环均有密切相关性[9-10]。

土壤硫的矿化主要取决于土壤的化学性质和生物学特性，而物理性质对土壤硫的影响很小[11]。有机硫矿化过程会发生一系列的生物学以及生物化学反应，受土壤性质、微生物活性、微生物及作物根系分泌物质等因素的影响[12]。而酶是土壤硫矿化的催化剂，Riffaldi等[13]研究发现潜性矿化硫与硫酸盐水解酶、芳基硫酸酯酶、蛋白酶和脱氢酶的活性显著相关。国内外许多研究结果均表明，植物有效硫的来源主要是土壤有机硫。有试验表明作物的生长期越长，有效硫的地位就越重要[14]。Freney等[15]的研究表明，在土壤中施用适量硫肥的处理有机硫的矿化更为剧烈，而有机硫矿化剧烈，矿化形成的无机硫酸盐含量提高，更有利于植物的吸收。有研究表明种植作物也许会刺激土壤有机硫的矿化，种植作物后比种植作物前土壤有机硫的矿化量提高[16-17]。

长期施肥有机硫转化的研究在红壤、潮土、黑土、褐土、草甸土等土壤类型的报道较集中[18-22]，而棕壤长期定位施肥有机硫变化研究比较少，并且长期定位施肥有机硫研究方面的种植制度多为短期或连作制度，对于轮作的研究较少，但很多试验证明土壤有机硫的矿化过程与地上作物的种植有密切关系。棕壤是我国重要的土壤类型，更是辽宁省主要土壤类型，目前对于长期施肥条件下，采用玉米–玉米–大豆轮作方式棕壤有机硫矿化特征有待深入研究，外界因子如温度、pH、有机碳、酶活性等是否会对有机硫矿化产生明显驱动均不十分清楚。关于长期定位试验对土壤硫的影响研究大多是侧重于硫元素的有效性，而对土壤供硫潜力等的研究不多。国内外关于长期定位施肥的土壤研究比短期肥料试验或盆栽试验少得多，对于影响有机硫矿化的因素的研究也不够详细[23-26]。故依托沈阳农业大学于1979年建立的棕壤肥料长期定位试验，系统地研究长期(36年) 不同处理玉米–大豆轮作体系中土壤有机硫矿化特征及其主要驱动因子。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验区位于沈阳农业大学棕壤肥料长期定位试验基地，试验始建于1979年，持续有36年。基地位于松辽平原南部的中心地带，属于温带湿润–半湿润季风气候，年平均降雨量为574～684 mm，平均气温7.0℃～8.1℃，无霜期为148～180天。试验从1979年开始，采用有机肥和无机肥不同处理配合及玉米–玉米–大豆轮作种植体系。土壤是发育在第四纪黄土性母质上的简育湿润淋溶土，1979年试验前土壤的基本化学性质为pH 6.5、有机碳9.18 g/kg、全氮 0.80 g/kg、碱解氮 105.5 mg/kg、全磷 0.38 g/kg、有效磷 6.5 mg/kg、全钾 21.1 g/kg、速效钾97.9 mg/kg[27-28]。

1.2 试验设计

试验采用裂区设计，分为化肥、低量有机肥和高量有机肥3个区组，共15个施肥处理，小区面积为 160 m2。本研究选用其中的 7 个处理：1) 不施肥(CK)；2) 低量化学氮肥 (N1)；3) 高量化学氮肥(N2)；4) 低量化学氮+磷肥 (N1P)；5) 低量化学氮+磷钾肥 (N1PK)；6) 低量有机肥 (M1)；7) 低量有机肥+低量化学氮+磷钾肥 (M1N1PK)。具体养分投入量见表1。

表 1 玉米和大豆季有机肥和化肥投入量 (kg/hm2)Table 1 Manure and chemical fertilizer inputs in maize and soybean season

有机肥采用腐熟的猪厩肥 (干重，平均养分含量为有机质 119.6 g/kg、N 5.6 g/kg、P2O58.3 g/kg、K2O 10.9 g/kg)，供试氮磷钾肥为尿素 (N 46%)、过磷酸钙(P2O512%、S 1.87%) 和硫酸钾 (K2O 50%、S 8.79%)，所有肥料均作为基肥在播种前一次施入。种植制度为玉米–玉米–大豆轮作，一年一熟。1992年起，种植大豆不再施有机肥。2014年大豆品种为沈农16号，密度150000株/hm2；2015年玉米品种为东单6531，密度60000株/hm2。

1.3 试验样品采集

定位试验每年作物收获后，每个小区分设3个次级小区，每个次级小区面积30 m2，作为每个处理的重复。每个次级小区随机选取5点，采集不同层次土壤样本，组成混合样，风干，保存于专用定位样本室，用于各项指标分析。本研究选取2014和2015 年耕层土壤 (0—20 cm) 样本进行各项指标分析，土壤常规化学指标见表2。

表 2 长期施肥条件下大豆季和玉米季土壤化学指标Table 2 Soil chemical properties in soybean and maize seasons under long-term fertilization

1.4 测定项目

1.4.1 土壤基本理化指标的测定 pH采用水土比2.5∶1浸提，pH计 (PHS-3C型，上海雷磁) 测定；有机碳、全氮采用元素分析仪 (Vario EL III，Germany) 测定。

1.4.2 有机硫矿化试验 矿化培养试验参照Pirela等[29]方法进行。称取风干土样30 g，石英砂30 g，将两者充分混合后置于淋滤管内，尽量保证淋滤管内的土样与石英砂均匀且松紧度一致。同一土样分别设置3次重复。为去除土壤之前矿化的硫酸盐，我们采用0.01 mol/L的CaCl2溶液浸润土壤平衡12 h后，再用0.01 mol/L的CaCl2溶液彻底的淋洗试验土壤，直至土壤再无SO42–被淋洗出来即可开始淋滤试验。为防止在添加溶液时会使淋滤管内土壤溅起，在倾倒溶液时在土壤表面覆盖一层滤纸，并且为淋滤管配置盖子以防止其中水分蒸发。将准备好的淋滤管分别放入20℃和30℃培养箱中，分别于培养第 2、4、6、8、10、12、14 周后，采用 75 mL CaCl2溶液淋洗，淋洗出的液体定容至100 mL容量瓶中后过滤，利用电感耦合等离子体原子发射光谱仪 (ICP-AES) 测定其中硫酸盐的含量。

1.4.3 芳基硫酸酯酶 (S-ASF) 与中性蛋白酶 (S-NPT)的测定 土壤芳基硫酸酯酶和中性蛋白酶分别采用S-ASF和S-NPT活性检测试剂盒，处理风干土壤样本，按照试剂盒标准说明进行各项操作，最后采用酶标仪 (Epoch，Bio Tek，USA)分别在 410和680 nm处比色测定。

1.4.4 土壤有机硫矿化动力学模型及其参数计算根据矿化淋滤试验所得数据，通过一级动力学方程计算得出有机硫的矿化潜力、矿化速率常数以及矿化半衰期。一级动力学方程为：

St=S0[1−exp(−kt)]

式中，S0为潜在矿化势；St为一定时间土壤硫累积矿化量；k为一级动力学常数；t为培养时间 (周)；t0.5为常数，代表矿化半衰期，潜在矿化势S0被矿化50%所需的时间 (周)。参数S0和k用下述方法求得。先将上式转化为：

S0−St=S0exp(−kt)

等式两端同时取对数，得：

ln(S0−St)=lnS0−kt

变形后的公式虽然是一直线型公式，但由于等式两端均含有欲求参数S0，所以需要先估算—S0代入公式左端后，以最小二乘法计算出公式右端的两参数S0和k；然后再将这一刚刚求出的S0代回等式左端进行第二次计算，以最小二乘法求得新的等式右端的S0和k，如此反复迭代计算，直至前后两次求出的S0相对误差小于0.0001，此时求得S0和k即为一级动力学方程式中的两参数。根据S0和k即可计算出t0.5(t0.5=0.693/k)[30]。

1.4.5 芳基硫酸酯酶及中性蛋白酶活力计算 1) 芳基硫酸酯酶：

每天每克土样中产生1 μmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

式中：T—反应时间，1 h=1/24 天；V反总—反应体系总体积，2.625×10–4L；W—样本质量，0.05 g。

2) 中性蛋白酶：每天每g土样中产生1 mg酪氨酸为一个S-NPT活力单位。

式中：C标准管—标准管浓度，0.05 mg/mL；V反总—反应体系总体积，0.2 mL；T—反应时间，30 min 为 1/48 天；W—样本质量，0.01 g。

1.5 数据处理与分析

采用Excel 2016作图和SPSS 22.0统计软件分析数据，采用单因素方差分析和邓肯法进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同温度和作物对土壤有机硫矿化量的影响

由图1可以看出，20℃条件下，随着培养时间的延长，有机硫矿化量逐渐增加；前4周矿化速率较快，土壤中有机硫大量进行矿化分解，分解量占总分解量的37.26%～56.01%，此后矿化量增幅变缓。不同施肥处理对有机硫矿化量的影响各不相同，7 个处理的总体变化趋势为 M1N1PK > M1>N1PK、N1、N2> N1P > CK。与 CK 相比，施用氮肥后，有机硫矿化量明显增加，但随着化学氮肥施用量的增加，有机硫矿化量没有明显变化。在只施用化肥的处理中，N1、N2和N1PK有机硫矿化量没有明显差别，但N1P处理的土壤有机硫矿化量却比其它处理降低了11.27%～12.70%。M1处理有机硫矿化量明显增加，较CK处理增加了47.92%，较单施化肥处理增加了3.78%～18.87%。M1N1PK处理有机硫矿化量在所有处理中最高，比CK处理提高了57.30%，比其它处理提高了6.34%～26.41%。30℃条件下，有机硫矿化总体趋势与20℃条件下相同，但有机硫矿化量整体都高于20℃条件下，平均增加幅度在6.20%～9.62%，温度升高有利于有机硫的矿化。玉米季有机硫矿化量总体趋势与大豆季相同，但有机硫矿化量总体比大豆年份高出6.17%～9.61%，玉米种植季有机硫矿化量高于大豆种植季。

图 1 矿化培养试验不同温度和作物下各处理土壤有机硫矿化量的变化Fig.1 Mineralization amount of soil organic sulfur in each treatment under different temperatures and crops in the laboratory culture test

2.2 有机硫矿化的动力学特征

一般土壤有机硫的累计矿化量与矿化时间之间符合一级动力学模型[30-31]，用一级动力学方程对土壤有机硫累计矿化量和培养时间进行拟合，得到土壤有机硫潜在的矿化量，即土壤有机硫矿化势 (S0) 和矿化常数 (k)[17]。

由表3可以看出，不同处理有机硫矿化采用一级动力学方程拟合效果比较好 (r> 0.938)[17]。在20℃的条件下，施肥处理的土壤有机硫矿化势均高于CK。随着化学氮肥施用量的增加，有机硫矿化势有所提高，但仅提高了0.03%。采用氮磷配合施用时，土壤矿化势有所降低，与单施氮肥相比降低了1.71%～2.01%；采用氮磷钾配合施用时，土壤有机硫矿化势与单施氮肥或氮磷配施相比均有所提高。M1处理的土壤有机硫矿化势明显高于其它所有施肥处理，提高了13.55%～45.27%。M1N1PK处理的有机硫矿化势低于单施有机肥的处理，但高于单施化肥的处理，尽管有机肥配施氮磷钾处理土壤矿化量最高(图1)，但其矿化势却低于单施有机肥处理，有可能是添加了氮磷钾化肥后，作物根系生长旺盛，促进了根系分泌物增多，提高了土壤中微生物活性，从而提高了其矿化量。在30℃的条件下，土壤有机硫矿化势总体变化规律与20℃条件下相同，但30℃下的土壤有机硫矿化势整体高出1.29%～6.61%。可以看出，温度的升高有利于土壤中有机硫的矿化。

表 3 大豆年份不同温度下有机硫矿化动力学方程参数Table 3 Kinetic equation parameters of organic sulfur mineralization under different temperatures in soybean season

由表4可以看出，玉米年份土壤矿化势在不同培养温度与处理之间的规律与大豆年份基本相同。对比表3、表4，土壤的有机硫矿化势呈增长趋势，20℃条件下，种植玉米的年份有机硫矿化势比种植大豆的年份提高了3.27%～6.19%，30℃条件下提高了0.23%～8.01%。

表 4 玉米年份不同温度下有机硫矿化动力学方程参数Table 4 Kinetic equation parameters of organic sulfur mineralization under different temperatures in maize season

2.3 有机硫矿化关键酶活性变化

由图2可知，在种植大豆的年份，与CK相比，除M1处理外，其余各施肥处理均显著提高了土壤中性蛋白酶的活性。单施化肥各处理 (N1、N2、N1P) 之间差异不显著，但N1PK处理的土壤中性蛋白酶活性显著高于其它单施化肥处理。M1N1PK处理的土壤中性蛋白酶活性显著高于单施化肥处理96%～220%；但单施有机肥处理中性蛋白酶活性却显著低于其它施肥处理34.78%～79.59%。在玉米种植季，中性蛋白酶活性大体趋势与种植大豆的年份相似，但单施化肥的各个处理 (N1、N2、N1P、N1PK) 之间差异不显著，且中性蛋白酶活性整体高于种植大豆的年份2.16%～60.69%。

图 2 棕壤有机硫矿化关键酶活性变化Fig.2 Changes of key enzyme activities of organic S mineralization in brown soil

在种植大豆的年份，除N2处理外，其它施肥处理均显著提高了土壤芳基硫酸酯酶活性。随着化学氮肥施用量的增加，土壤芳基硫酸酯酶活性没有显著变化。在单施化肥的处理中，N1和N2之间差异不显著，N1P和N1PK处理的土壤芳基硫酸酯酶活性显著高于N1和N2两个处理，其中N1PK处理的土壤芳基硫酸酯酶活性最高。M1处理土壤芳基硫酸酯酶活性显著高于除N1PK处理外单施化肥的各个处理，M1N1PK处理的土壤芳基硫酸酯酶活性最高，远高于其它任何一个处理，提高了264%～986%。在种植玉米的年份，与CK相比，各施肥处理均显著提高了土壤芳基硫酸酯酶活性；其变化趋势与种植大豆的年份相同。

2.4 有机硫累积矿化总量与土壤性质的关系

由表5可以看出，种植大豆的年份有机硫累积矿化总量尽管受温度影响较大，随着温度增高有机硫矿化量增加，但与土壤pH、有机碳以及全氮含量相关性均不显著。种植玉米的年份有机硫累积总矿化量与土壤有机碳含量和全氮含量呈显著正相关，其矿化总量受土壤有机碳和全氮含量影响较大；与土壤pH没有显著相关性。利用7个处理不同年份的作物籽粒产量与不同温度下有机硫矿化总量进行线性拟合发现，r值在0.39～0.70，尽管随着有机硫矿化总量的增加，作物产量有增加趋势，但均未达到显著差异水平。

表 5 大豆和玉米季土壤pH、有机碳、全氮含量与有机硫累积矿化总量的关系Table 5 Relationship between soil pH, organic carbon, total nitrogen and cumulative total mineralization of organic sulfur in soybean and maize seasons

3 讨论

土壤有机硫矿化是土壤有效硫的重要来源，在土壤中有机硫的矿化与有效硫的固定是同时进行的两个过程。在这个动态平衡中土壤微生物发挥着重要作用，影响微生物活性的因素，如温度、水分、可利用碳源等都影响着平衡点的变化[32]。本研究结果表明，随着培养时间的延长，有机硫累积矿化量与时间呈直线关系，温度升高使有机硫累积矿化量增加，这与Pirela等[29]的研究结果基本一致。不同的是本研究中的土壤有机硫矿化较快，在第4周时就达到了矿化总量的50%左右，而Pirela等[29]的研究中，20℃和30℃下14周的矿化量分别占有机硫总量的1.2%～9.8%和2.4%～17.5%，这可能由于土壤类型、作物种类、试验年限不同导致的。Pirela等[29]培养研究表明，20℃和30℃下开放培养土壤有机硫累积矿化量与时间也呈直线关系。一般认为温度在10℃时，矿化作用明显受阻碍，在20℃～40℃，矿化量随温度升高而增加，40℃以上又降低。本研究中未设定10℃和40℃，因为根据当地作物生长气候条件，一般5月初种植，9月末收获，温度一般极少会出现低于10℃或高于40℃。

不同施肥措施对棕壤有机硫的矿化特征有明显的影响。对照处理由于长期 (36年) 不施肥，作物吸收的硫主要是土壤中原有的硫素，使土壤硫的储量下降，土壤有机硫矿化能力下降。单独施加有机肥和有机肥配施氮磷钾肥的处理土壤有机硫矿化量高于其它处理，主要原因是有机肥本身携带一部分有机硫，致使土壤有机硫库增大；其次有机肥在矿化分解和腐殖化过程中均需要微生物的参与，土壤微生物活力增高，有机硫矿化加快[30]。本研究中，有机硫矿化势最高的是单独施加有机肥的M1处理，其次才是M1N1PK处理，这与迟凤琴等[30]研究结果一致，黑土的有机硫矿化势在20℃和30℃时以施用有机肥的M处理为最大，其次为MNPK处理，再次为NPK处理，而以未施肥处理CK为最小。可见，棕壤有机硫矿化规律与黑土较为类似，施用有机肥使土壤中有机硫含量增高，其矿化势也会变大，即供硫潜力越大。

蛋白酶是影响土壤中氮元素的主要酶之一，其生物活性会影响土壤中氮的转化过程，而土壤中的碳、氮含量对土壤硫均有很大的影响，并且蛋白酶的活性与其它硫转化相关酶的活性之间存在一定程度的相互关系，也会对有机硫的矿化过程产生影响[33]。在本试验条件下，两种酶的变化规律各有不同，从整体来看，长期施肥处理均可提高中性蛋白酶和芳基硫酸酯酶的活性，说明施肥对提高两种酶的活性有促进作用，效果最好的为有机肥配合化肥处理。

大部分研究表明，土壤硫的矿化与土壤pH相关性不显著[10, 13, 29, 34]，也有研究发现不同土壤硫矿化与pH既呈正相关，也呈负相关关系[35]。Ghani等[31]发现在10周的培养期间14%～54%的新形成的有机硫被矿化。有机物质的C/S值也会影响硫的释放或固定，C/S值为200时矿质化占优势，土壤净获得SO42–；C/S值大于400时，以固定作用为主，发生SO42–的净丢失；C/S 值在 200～400，SO42–既不丢失也不获得。所以土壤有机碳可通过影响土壤中的C/S值来促进土壤有机硫的矿化。有机碳可以促进土壤团聚体的形成[36-39]。有研究发现，全氮对土壤团聚体的形成有很大影响[40]，并且土壤中95%的全氮以有机态存在，这有利于有机–无机胶结作用，土壤团聚体有利于养分的保存，可以改善土壤不良物理性状。因此有利于土壤微生物的活动，提高土壤微生物的活性，使有机硫矿化加快。本研究结果表明，在30℃时长期施肥棕壤有机硫矿化量主要受土壤有机碳含量和土壤全氮含量影响，而与土壤pH无关。这也有可能是受土壤C/S值或土壤全氮含量影响团聚体而导致的直接或间接效果。通过了解长期施肥土壤有机硫矿化的主要驱动力，提高硫素生物效应，发挥C、N、S协同效应，有效提高棕壤土壤肥力，保障农业可持续发展。

4 结论

土壤中有机碳和全氮是棕壤有机硫矿化的主要驱动力。只施用无机肥对土壤有机硫的矿化没有明显影响，而有机无机肥配合施用可显著提高土壤芳基硫酸酯酶、中性蛋白酶活性，进而提高有机硫矿化势和矿化量。玉米因其较高的生物量也成为有机硫矿化的主要驱动力。