蚯蚓磨浆发酵产物减轻苹果连作障碍的机制

潘凤兵，姜伟涛，陈 冉，徐明娜，陈学森，沈 向，尹承苗，毛志泉*

（1 山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018；2 龙口市农业技术推广中心，山东烟台 265701）

苹果连作障碍又叫苹果再植病 (apple replant disease，ARD)，指在曾栽种过苹果树的老果园里再次种植苹果幼树时出现新树长势弱甚至死亡的现象，典型的苹果连作障碍表现为植株矮小、生长衰弱且成活率低，果实产量降低、品质变劣[1-3]。受土地资源限制，苹果连作障碍的发生已经成为我国苹果主产区一个普遍存在、亟需解决的生产问题，严重制约了我国苹果产业的可持续发展[4]。

苹果连作障碍的成因复杂，主要可分为非生物因素和生物因素两部分[5-6]。大量研究表明，生物因素是引起苹果连作障碍的主要原因[7-9]，其中连作土壤中的各种真菌和卵菌被认为是引起苹果连作障碍的关键因子[10-11]，同时以酚酸类物质为主的化感自毒物质是引起连作障碍的重要因素[3, 12]。同时大量研究表明，蚯蚓体液中含有的小分子肽具有广谱的抗微生物活性[13-15]。张希春等[16]通过硫酸铵沉淀、超滤和阳离子交换分离，从蚯蚓匀浆液中得到的2种新的抗菌肽具有高效广谱抗菌活性。Wolfarth等[17]的研究发现，利用流蚓属蚯蚓覆盖处理秸秆残渣，可显著降低镰刀菌属 (Fusarium) 真菌的数量。Plavšin 等[18]的研究发现蚯蚓体液提取物对农业生产中重要的植物病原真菌尖孢镰刀菌的生长有抑制作用，且两种不同种类蚯蚓的提取物均能抑制尖孢镰刀菌的生长，72 h后这种抑制作用更加明显。研究表明，通过微生物发酵动植物等蛋白底物可产生具有抗菌活性的生物活性肽，其具有广谱抗菌活性，可以有效对抗农业中的植物细菌真菌感染[19-21]。近年来，抗菌肽已先后应用于医药、食品和农业等方面[22-23]，但关于抗菌肽对土壤有害微生物和果树连作障碍的影响研究尚未见报道。

本试验以苹果树栽培中的常用砧木[24]平邑甜茶为试材，探究连作条件下施入蚯蚓磨浆发酵产物对连作土壤微生物环境、土壤酚酸类物质和平邑甜茶幼苗生物量、根系构型、根系抗氧化酶活性和叶片叶绿素含量及光合指标的影响。探究蚯蚓磨浆发酵产物对苹果连作障碍的防控效果，并初步探明其作用机理，以期为有效防治苹果连作障碍提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的老苹果园连作土壤取自山东省泰安市满庄镇27年生的红富士老果园，砧木为八棱海棠(MalusrobustaRehd.)。土壤类型为棕壤，速效磷含量为 15.85 mg/kg、速效钾含量为 152.05 mg/kg、铵态氮含量为13.09 mg/kg、硝态氮含量为7.68 mg/kg、土壤pH为6.2、有机质含量为9.35 g/kg。

供试材料为平邑甜茶 (MalushupeheusisRehd.) 实生苗。供试蚯蚓为大平1号蚯蚓 (Eiseniafoetida)，发酵菌种为枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis) 和黑曲霉菌 (Aspergillusniger)。

试验用盆为上部内径25 cm、底部内径17 cm、高18 cm的陶制花盆。

1.2 试验设计

试验于2018年在山东农业大学国家苹果工程技术研究中心试验基地进行。试验设置5个处理：连作土对照 (CK)、连作土灭菌 (T1)、蚯蚓磨浆发酵产物 (T2)、蚯蚓磨浆发酵产物灭菌 (T3)、蚯蚓匀浆(T4)。连作土灭菌采用高温高压蒸汽灭菌法 (120℃，30 min)，蚯蚓磨浆发酵产物采用巴氏消毒法。

蚯蚓磨浆发酵产物制备方法为：将新鲜蚯蚓与水 (质量比4∶1) 在组织匀浆仪中进行匀浆制得组织匀浆液，组织匀浆液经巴氏消毒后接入发酵菌，发酵菌与组织匀浆液的加入比例是1∶1000，枯草芽孢杆菌的有效活菌数为 1×109CFU/mL，黑曲霉菌的孢子浓度为 1.2×109CFU/mL，将接种后的组织匀浆液置于37℃条件下有氧发酵 (PTFE无菌封口膜将发酵瓶封口，每日早中晚3次摇匀发酵瓶增加发酵液中溶解氧含量) 10 天。

按试验设计处理连作土壤并装盆，每个处理20盆，每盆6.5 kg供试土壤。蚯蚓磨浆发酵产物、灭菌发酵产物和蚯蚓匀浆的施用量一致，每盆32.5 mL。于4月底选取3棵长势一致的平邑甜茶实生苗移栽到装有不同处理供试土壤的花盆中，待缓苗结束后间苗保留2棵长势一致的植株。平邑甜茶幼苗移栽后，所有处理均采用统一肥水管理，分别于8月底取样测定土壤微生物环境、平邑甜茶幼苗生物量、根系相关指标以及叶片叶绿素含量、叶片光合参数等指标。

1.3 测定指标

土壤微生物总量的测定：采用常用的稀释平板计数法测定。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基37℃条件下培养，真菌采用PDA选择性培养基28℃条件下培养，放线菌采用改良高氏培养基28℃条件下培养[25]。

实时荧光定量 (real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)：参照尹承苗等[26]的方法，提取土壤总DNA并纯化；参照王功帅[27]的方法设计特异性引物，采用 CFX96TMThermal Cycler (Bio-Rad) 对不同处理的连作土壤中镰孢菌的基因拷贝数进行定量分析[28]。

土壤酚酸类物质含量测定：连作土壤风干后过12目筛，称取80 g风干土壤，加入适量石英砂，于大研钵中混合均匀，按照Wang等[29]的方法进行提取和测定。

生物量的测定：平邑甜茶幼苗株高、径粗的测定分别使用卷尺、游标卡尺，植株鲜重、干重的测定采用万分之一天平。

根系形态指标的测定：参照肖宏等[30]的方法，采用专业版WinRHIZO根系分析系统对各样品根系图像进行分析处理，记录幼苗根系平均直径、总体积、总表面积、根尖数等根系构型参数。

根系呼吸速率的测定：采用氧电极自动测定系统 (Qxytherm System，Hansatech 公司) 测定样品呼吸速率[31-32]。

根抗氧化酶的测定：超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用氮蓝四唑 (NBT) 光还原法[33]，过氧化物酶(POD)的活性按Omran等[34]的方法测定，过氧化氢酶(CAT)活性按照Singh等[35]的方法测定。

叶片光合参数的测定：于8月20日 (晴天，无风) 上午9:00选取3株长势一致植株自上向下第3～5片健康功能叶，采用CIRAS-3便携式光合仪(PP System，英国) 测定净光合速率 (Pn)、气孔导度(Gs)、胞间 CO2浓度 (Ci)、蒸腾速率 (Tr) 等光合参数。测定内源光强为 450 μmol/(m2·s)，CO2浓度为360 μL/L，叶室温度为 25℃。

叶绿素含量的测定：采用乙醇浸提法测定叶片叶绿素含量[33]。

1.4 数据分析

试验数据通过 Microsoft Excel 2010 进行处理，通过SPSS 19.0进行方差分析，采用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检测。

2 结果与分析

2.1 蚯蚓磨浆发酵产物对连作土壤微生物环境的影响

2.1.1 蚯蚓磨浆发酵产物对土壤微生物总量的影响由图1可以看出，T2蚯蚓磨浆发酵产物、T3灭菌蚯蚓磨浆发酵产物都能显著改善连作土壤环境，具体表现为促进了细菌、放线菌数量，降低了真菌数量；T4蚯蚓匀浆显著降低了真菌数量，但细菌、放线菌数量未显著提高。T2、T3处理的效果仅次于T1处理，且显著高于连作对照CK，其中细菌数量分别比CK提高了102.5%和96.3%，放线菌数量分别比CK提高92.5%和83.3%，而真菌数量分别降低了54.5%和39.2%，均达显著性差异。

图 1 不同处理土壤微生物数量Fig.1 The number of soil microorganisms under different treatments

2.1.2 蚯蚓磨浆发酵产物对土壤连作有害真菌数量的影响 T2、T3、T4处理均能显著降低连作土壤中有害真菌的数量，其中T2蚯蚓磨浆发酵产物的效果最为明显，T2处理中的有害真菌尖孢、层出、腐皮、串珠等镰孢菌数量相比CK连作对照分别降低了65.6%、13.9%、84.2%和24.1%；T3处理仅次于T2处理，且与T2处理未达到显著差异，其尖孢、层出、腐皮、串珠等镰孢菌分别比CK降低了63.4%、22.3%、74.3%和13.55% (表 1)。

表 1 不同处理土壤中镰孢菌基因拷贝数 (copies/g, soil)Table 1 Gene copies of Fusarium in soils under different treatments

2.2 蚯蚓磨浆发酵产物对连作土壤酚酸类物质含量及平邑甜茶幼苗根系的影响

2.2.1 蚯蚓磨浆发酵产物对连作土壤酚酸类物质含量的影响 由表2可以看出，连作对照和T1处理的酚酸类物质含量明显高于添加了蚯蚓磨浆发酵产物的处理，同时蚯蚓磨浆发酵产物灭菌与未灭菌的效果差异不大。相较于连作对照CK，T2蚯蚓磨浆发酵产物处理的土壤中根皮苷、根皮素、肉桂酸、苯甲酸和对羟基苯甲酸含量分别降低了74.2%、48.9%、50.5%、69.7%和67.0%，均达到显著性差异。

表 2 不同处理下连作土壤中酚酸类物质含量 (mg/kg, dry soil)Table 2 The concentration of phenolic compounds in replanted soil under different treatments

2.2.2 蚯蚓磨浆发酵产物对平邑甜茶幼苗根系形态的影响 表3结果表明，与CK相比，T2、T3处理显著促进了平邑甜茶根系的生长，T4对根系生长的促进作用不明显。T2、T3处理的根系指标与CK相比均有显著性差异，T2处理的总根长、表面积、根体积和根尖数分别比CK增加了78.0%、67.7%、88.4%和159.4%；T3处理分别增加了57.1%、40.6%、87.2%和125.2%。

表 3 不同处理下苹果幼苗 (M.hupehensis Rehd.) 细根发育状况Table 3 Development of fine roots of apple seedlings (M.hupehensis Rehd.) under different treatments

2.2.3 蚯蚓磨浆发酵产物对平邑甜茶幼苗根系呼吸速率和抗氧化酶活性的影响 由图2可以看出，T2、T3、T4处理均可不同程度地提高平邑甜茶幼苗根系抗氧化酶活性，具体表现为 T2 > T3 > T4 >CK；与CK相比，T2处理的SOD、POD和CAT活性分别提高了81.2%、81.1%和161.5%，均达显著性差异。T2、T3处理也显著提高了根系呼吸速率，分别比CK提高了69.4%和64.8%。

图 2 不同处理苹果幼苗 (M.hupehensis Rehd.) 根系呼吸速率和抗氧化酶活性Fig.2 Respiration rate and antioxidant enzymes activity of roots of apple seedlings (M.hupehensis Rehd.)under different treatments

2.3 蚯蚓磨浆发酵产物对平邑甜茶幼苗生物量及叶片光合参数的影响

2.3.1 蚯蚓磨浆发酵产物对平邑甜茶幼苗生物量的影响 由图3可知，所有处理均不同程度地促进了平邑甜茶幼苗的生长。除T1处理灭菌土外，T2、T3处理效果最为显著，T2、T3处理的植株干重是连作对照CK的2.58和2.19倍；T4处理蚯蚓匀浆虽促进了植株干重的增加，但与CK未达显著性差异。

2.3.2 蚯蚓磨浆发酵产物对平邑甜茶幼苗叶片光合参数的影响 由图4可知，除T1处理灭菌土外，T2显著提高了平邑甜茶幼苗叶片的净光合速率(Pn)、蒸腾速率 (Tr) 和气孔导度 (Gs)，T3 对净光合速率的影响显著。与CK相比，T2处理的Pn、Tr和Gs分别提高了46.5%、21.6%和41.0%。各处理间胞间 CO2浓度 (Ci) 值差异不显著。

图 4 不同处理苹果幼苗 (M.hupehensis Rehd.) 叶片的光合参数Fig.4 Photosynthetic parameter in leaves of apple seedlings (M.hupehensis Rehd.) under different treatments

2.3.3 蚯蚓磨浆发酵产物对平邑甜茶幼苗叶片叶绿素含量的影响 除T1处理灭菌土外，蚯蚓磨浆发酵产物T2、T3、T4处理均可不同程度地提高平邑甜茶幼苗叶片的叶绿素含量，其中T2处理的效果最明显，T3和T4未达显著性差异。T2处理叶片的叶绿素 a (Chl.a)、叶绿素 b (Chl.b) 和类胡萝卜素 (Car.)分别是CK的1.38、1.65和1.16倍，均达到显著性差异 (表 4)。

表 4 不同处理下苹果幼苗 (M.hupehensis Rehd.) 叶片的光合色素含量 (mg/g，FW)Table 4 The photosynthetic pigment contents in leaves of apple seedlings (M.hupehensis Rehd.) under different treatments

3 讨论

微生态系统的综合功能失调是造成苹果连作障碍的主要原因[3]，而有害真菌数量的增加则是打破连作土壤中微生态系统平衡的重要原因[9, 11]。Kelderer等[7]的研究表明，尖孢镰孢菌 (F.oxysporum)、腐皮镰孢菌 (F.solani)、柱孢属真菌 (Cylindrocarponspp.) 和双核丝核菌 (BinucleateRhizoctoniaspp.) 是引起意大利地区苹果连作障碍的主要病原菌。同时也有研究表明，导致中国苹果主产区连作障碍发生的主要原因是镰孢属真菌的增多[2]，王功帅[27]对发生苹果连作障碍土壤中的有害镰孢菌进行了分离鉴定，结果表明分离的镰孢菌主要分为尖孢镰孢菌 (F.oxysporum)、层出镰孢菌 (F.proliferatum)、腐皮镰孢菌 (F.solani)和串珠镰孢菌 (F.moniliforme)。研究发现通过酶解或微生物发酵动植物昆虫蛋白底物的方法可产生具有生物活性的抗菌小肽，这些小分子肽对微生物有广谱的抗菌活性，可以有效对抗农业生产中的植物细菌真菌感染[18-19, 36]。本研究中，蚯蚓磨浆发酵产物的添加促进了连作土壤中细菌、放线菌数量的增加，有效降低了真菌数量，qPCR结果显示蚯蚓磨浆发酵产物有效降低了尖孢、层出、腐皮和串珠4种有害真菌的数量，这对改善苹果园连作土壤微环境起到了非常积极的作用，该研究结果与Plavšin等[18]的研究结果一致。分析认为，蚯蚓磨浆发酵产物中的某种或某几种物质对连作土壤中的有害真菌起到了灭杀作用，从而改变了连作土壤微生物环境，但具体为哪种物质起到了抑菌作用及其抑菌机理尚需进一步明确。

大量研究表明，酚酸类物质是引起包括苹果、人参、西瓜等多种作物发生连作障碍现象的主要因素之一[37-39]。连作障碍的发生与连作土壤中酚酸等化感物质的积累密切相关[40]，当土壤中酚酸类物质积累到一定的浓度时会抑制作物的生长[41]，使作物出现连作障碍现象[42]。本研究发现，蚯蚓磨浆发酵产物的施入明显降低了苹果连作土壤中酚酸类物质的含量，这可能是因为蚯蚓磨浆发酵产物对连作土壤微生物环境的影响导致的，在降低有害真菌数量的同时增加了有益菌的菌群数量，使酚酸类物质大量分解。这与姜伟涛等[43]研究中发现的酚酸类物质可与连作致病真菌产生协同效应，根皮苷和串珠镰孢菌可共同作用，从而加重苹果连作障碍现象的研究结果一致。

尹承苗等[37]的研究表明，连作土壤中的5种土壤实测浓度的酚酸类物质对平邑甜茶幼苗根系的生长有极大的抑制作用。连作条件下，果树幼苗的总根长和平均根直径均会出现不同程度地下降，这些根系指标的下降导致了根系对水分及养分吸收能力的降低，最终使得植株干物质积累量的减少，进而导致作物连作障碍的发生[42]。王树凤等[44]的研究也表明，逆境条件下，植物根系生长会受到抑制，进而影响根系在逆境土壤中的分布范围，影响植物对水分和营养元素的吸收，进而影响植物生长。本研究中，蚯蚓磨浆发酵产物明显促进了连作条件下平邑甜茶幼苗根系的生长，保证了植株从土壤中对水分和营养元素的正常吸收，有利于植株的正常生长。研究发现，一定浓度的肉桂酸会降低平邑甜茶幼苗根系基础呼吸速率[31]，而一定浓度的根皮苷可降低三羧酸循环中相关酶活性，致使平邑甜茶根系呼吸速率下降[45]。同时，植物在逆境条件下，活性氧大量积累，SOD、POD和CAT等保护性酶活性却呈现降低趋势，使植物体内的抗氧化酶系统与活性氧之间的动态平衡被打破，细胞不能及时清除多余的活性氧而对植物造成伤害[46]。在连作土壤中，由于土壤中微生物环境恶化、酚酸等化感类物质积累及土传病害加重等原因，致使植物根系内的活性氧大量产生并积累，进而伤害植株根系，影响根系对营养元素和水分的吸收和利用，导致连作障碍的发生[47]。本研究中，添加蚯蚓磨浆发酵产物后，植株根系呼吸速率和根系保护性酶的活性都得到显著提高，这对促进根系健康生长，提高根系对营养物质的吸收效率、提高植株抗逆性和对连作土壤的适应性，从而促进植株健康生长减轻连作障碍造成的危害具有重要意义[48]。

生物量是表征作物植株生长发育的重要指标，当连作障碍发生时，果树会出现植株矮小、根系分生能力差、植株生长发育缓慢等现象[4, 10]。而在本试验中，蚯蚓磨浆发酵产物的施入使平邑甜茶幼苗的株高、径粗都有明显提高，同时也促进了干物质量的积累。光合作用是植物的基础代谢活动，且作物的产量和品质又与光合作用密切相关，光合作用对逆境胁迫非常敏感，任何逆境都会给植物的光合作用造成不利影响。在逆境条件下，植株叶片的净光合速率和蒸腾速率等光合参数会出现明显下降[49]。叶绿素是主要的光合色素，在光合作用中具有吸收、传递和转化光能的功能。杨萍等[50]的研究表明，在自毒作用下，叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量均会明显降低。本研究中，施入蚯蚓磨浆发酵产物后，植株叶片中的叶绿素含量明显提高，净光合速率等叶片光合作用参数也得到有效提高，可能原因是发酵产物中的营养成分被植株吸收促进了植株生长，从而进一步促进了植株光合效率的提高，为植株健康生长提供了有效保障。

4 结论

本研究中，蚯蚓磨浆发酵产物的添加显著改善了连作土壤微生物环境，降低了连作土壤中酚酸类物质的含量，促进平邑甜茶植株根系生长及根系抗氧化酶活性，提高了植株叶片的叶绿素含量及光合作用效率，促进了连作条件下植株的生长，有效降低了苹果连作障碍的危害。综合研究结果可知，蚯蚓磨浆发酵产物可能从改善连作土壤微生物环境和营养成分促进植株生长两方面缓解了连作障碍造成的危害，但蚯蚓磨浆发酵产物中的何种成分起到关键作用及其作用的机制还需进一步探讨和研究。