RSV下呼吸道感染患儿血清miR-146a、miR-155的表达及意义

黄 佩，翟 敏，廖廷彦

湖北省枣阳市第一人民医院儿科，湖北枣阳 441200

呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿下呼吸道感染的常见病毒，RSV感染可导致免疫损伤，患儿出现咳嗽、气促、喘憋等症状[1-2]。微小RNA(miRNA)可作为免疫系统和免疫反应的调节元件参与人体免疫调节[3-4]。miR-146a在体内充当炎症调节剂，可影响核转录因子-κB(NF-κB)途径及丝裂原活化蛋白激酶途径[5]。miR-155在自身免疫和其他慢性炎症性疾病中发挥作用，影响机体炎性反应[6-7]。miR-146a和miR-155参与调节多种疾病的炎性反应，但二者在RSV下呼吸道感染中的作用报道较少。本研究探讨miR-146a、miR-155在RSV下呼吸道感染中的表达及意义，以期为该病的治疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年4月至2019年12月本院就诊的97例RSV下呼吸道感染患儿作为试验组，其中男53例，女44例；平均年龄(3.49±1.18)岁。选取同期在本院进行常规体检的101例健康儿童作为对照组，其中男59例，女42例；平均年龄(3.67±1.26)岁。2组年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。记录所有受试儿童的身高、体质量等，计算体质量指数(BMI)。纳入标准：(1)符合《诸福棠实用儿科学(第8版)》中下呼吸道感染诊断标准者[8]；(2)RSV检测呈阳性者；(3)就诊前2周未使用激素或药物治疗者；(4)5岁以下儿童。排除标准：(1)合并其他慢性疾病者；(2)呼吸道畸形者；(3)先天免疫缺陷者。本研究经本院伦理委员会批准，所有受试儿童家属均签署知情同意书。

1.2仪器与试剂 Trizol试剂盒(批号DXT-15596018)购自上海科敏生物科技有限公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒(批号K1621)购自杭州主诺生物技术有限公司；SYBR Green PCR Master Mix实时荧光定量PCR(qPCR)检测试剂盒(批号DXT-ST600580)购自密理博(中国)有限公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-10及超敏C-反应蛋白(hs-CRP)检测试剂盒(批号分别为ARB13479、ARF11752、ARB10557、AKF00479)购自北京百奥莱博科技有限公司；qPCR仪(型号100133)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；血细胞分析仪(型号DxH800)购自美国贝克曼库尔特有限公司；希森美康血球仪(型号XN-2000)购自日本希森美康株式会社。

1.3方法

1.3.1标本采集 抽取2组儿童的空腹外周静脉血5 mL，加入乙二胺四乙酸抗凝，4 000 r/min离心5 min，吸取上清液于小型离心管中，分装于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2血清中炎症因子及相关指标检测 采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清中TNF-α、IL-6、IL-10及hs-CRP水平；采用血细胞分析仪测定血清中血红蛋白和清蛋白水平；采用流式细胞术检测白细胞、红细胞、中性粒细胞及淋巴细胞数量。

1.3.3qPCR测定血清miR-146a、miR-155水平 从-20 ℃取出标本，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，并检查纯度和完整度；按照反转录试剂盒说明书操作，所得cDNA存于-20 ℃冰箱保存。qPCR反应体系(20 μL)：cDNA模板1 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，H2O 8 μL。根据目的基因设计其上下游引物，以U6为内参，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列见表1。反应条件：95 ℃ 20 s；95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s，35个循环。根据各标本平均循环阈值(Ct)，采用2-ΔΔCt法计算miR-146a、miR-155水平。

表1 miR-146a、miR-155及内参基因U6引物序列

2 结 果

2.12组一般情况比较 2组BMI、白细胞、红细胞比较，差异无统计学意义(P>0.05)；试验组血红蛋白、清蛋白水平，以及中性粒细胞数量均低于对照组(P<0.05)，淋巴细胞数量高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 2组一般情况比较

2.22组血清miR-146a、miR-155水平比较 试验组血清miR-146a、miR-155水平均高于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 2组血清miR-146a、miR-155水平比较

2.32组血清炎症因子水平比较 试验组血清TNF-α、IL-6、IL-10和hs-CRP水平均高于对照组(P<0.05)。见表4。

表4 2组血清炎症因子水平比较

2.4RSV下呼吸道感染患儿血清miR-146a、miR-155水平与炎症因子的相关性 RSV下呼吸道感染患儿血清miR-146a、miR-155水平均与TNF-α、IL-6、IL-10和hs-CRP水平均呈正相关(P<0.05)。见表5。

表5 RSV下呼吸道感染患儿血清miR-146a、miR-155水平与炎症因子的相关性

2.5影响 RSV下呼吸道感染的多因素分析 将RSV下呼吸道感染是否发生作为因变量，以miR-146a、miR-155、TNF-α、IL-6、IL-10、hs-CRP、血红蛋白、清蛋白、中性粒细胞和淋巴细胞作为自变量进行Logistic回归分析，结果显示高水平的miR-146a、miR-155、TNF-α和IL-10均是影响RSV下呼吸道感染的独立危险因素(P<0.05)。见表6。

表6 影响RSV下呼吸道感染的多因素分析

3 讨 论

RSV感染是世界范围内5岁以下儿童死亡的主要原因之一，婴幼儿易受到RSV病毒感染，其中约2/3为上呼吸道感染，1/3为下呼吸道感染[9]。RSV可导致毛细支气管炎，可能会造成儿童哮喘。RSV感染会导致肺部损伤，并在儿童生长阶段长期削弱肺功能，致使持续的气道高反应[10]。研究表明，在严重RSV感染的婴儿中TNF-α水平较健康婴儿高[11]。在RSV感染患儿的洗鼻液中发现可溶性细胞间黏附分子-1、IL-10及IL-6水平与疾病严重程度相关[12]。RSV下呼吸道感染已被证实与反复性喘息有关，并可能在患儿成年后对其呼吸系统产生一定的影响[13]。本研究检测RSV下呼吸道感染患儿血清中炎症因子水平，结果显示，RSV下呼吸道感染患儿血清TNF-α、IL-6、IL-10和hs-CRP水平均高于健康儿童，与上述结果一致，提示RSV下呼吸道感染可导致炎性反应。临床上对于RSV下呼吸道感染暂无有效干预措施，缺乏特异性治疗，因此探寻RSV下呼吸道感染的治疗靶点是当前的研究热点。

miRNA可参与人体多种生理反应，部分miRNA对炎性反应具有调节作用。miR-146a是miR-146家族成员，位于人5号染色体上，可抑制NF-κB通路活化，抑制炎性反应或维持免疫稳态[14]。miR-146a在几种自身免疫性疾病的发病过程中起重要作用，如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎和银屑病等[15]。GUAN等[16]发现，在miR-146a转染的人软骨细胞中，IL-6、IL-8和TNF-α水平降低，miR-146a可抑制软骨细胞中的重要炎症因子。王盼等[17]研究表明，哮喘儿童血清中miR-146a水平升高，提示miR-146a水平可能与哮喘发病有关。miR-155被认为是促炎因子，可调节细胞因子的产生，从而在先天性免疫反应中发挥作用[18]。miR-155表达受Toll样受体/NF-κB通路调控，其靶基因多为抗炎因子，miR-155通过抑制其靶基因发挥促炎作用[19]。SINGH等[20]发现，风湿性关节炎患者血清miR-146a、miR-155水平均高于健康人群，并对风湿性关节炎有一定诊断价值。本研究发现，RSV下呼吸道感染患儿血清miR-146a、miR-155水平均高于健康儿童，提示miR-146a、miR-155可能参与RSV下呼吸道感染的发病进程。通过Pearson相关分析miR-146a、miR-155水平与炎症因子的相关性，发现RSV下呼吸道感染患儿血清miR-146a、miR-155水平均与TNF-α、IL-6、IL-10和hs-CRP水平呈正相关，提示二者水平能够反映出RSV下呼吸道感染患儿的炎症状况；Logistic回归分析发现，高水平的miR-146a、miR-155、TNF-α和IL-10均是影响RSV下呼吸道感染的危险因素，提示降低miR-146a、miR-155水平可能会抑制RSV下呼吸道感染的发生发展。

综上所述，RSV下呼吸道感染患儿血清miR-146a、miR-155水平较高，二者均是RSV下呼吸道感染的影响因素。提示miR-146a、miR-155可作为评估RSV下呼吸道感染患儿炎症状态的参考指标，有望成为干预或治疗RSV下呼吸道感染的潜在靶点。