PM2.5中不同组分对人脐静脉内皮细胞的联合毒性作用研究

刘洁仪，张 睿，夏 冬，李 镕，李晓雯，陈姿旭，魏 青，赵志强，*，何 云，*

(1.中山大学公共卫生学院毒理学教研室，广东广州 510080；2.中山大学公共卫生学院实验教学中心，广东 广州 510080)

近年来，雾霾天气频发，空气污染问题愈发严重，已经成为世界范围内影响人群健康的重大公共卫生事件之一。大气细颗粒物(fine particulate matter，PM)是造成空气污染的主要成分之一，其粒径小、比表面积大，易吸附空气中其他有害物质，从而对人体健康产生更大的威胁。PM可以随着呼吸道进入肺泡，通过气血屏障进入循环系统，引起细胞氧化应激、炎症反应等，造成血管内皮功能障碍从而诱发心血管疾病，也可以通过损伤大脑血管内皮之间的紧密连接，破坏血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的完整性并进入大脑，同时还有其他炎症因子从破坏的BBB 进入脑部，从而诱导阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的发生。大量证据显示，短期或长期暴露于PM会导致心血管不良事件如心肌梗死、心律失常、动脉粥样硬化等事件的发生率增加，从而导致心血管疾病死亡率增加。此外，有研究表明长期暴露于高浓度PM会导致大脑结构损伤，认知功能下降，AD 相关标志物表达升高，证明 PM与 AD 的发生有密切联系。

PM是一种极其不均匀的混合物，包含多种成分，如有机碳化合物、元素碳、重金属等，然而其中某种成分或某几种成分联合暴露对于心血管疾病或AD 的毒性机制尚不明确，因此有必要对PM中不同组分进行研究。纳米炭黑颗粒是空气污染物中超细粒子的重要组成，主要来自燃料不完全燃烧时产生的烟灰，微米级的二氧化硅尘土颗粒也是大气颗粒物的重要组成部分，现有证据表明，炭黑暴露会损害心脏功能，引起心血管疾病的发生，长期暴露于二氧化硅也可以增加心血管疾病的死亡率。同时有研究表明，超细炭黑颗粒可以引起细胞氧化应激，使细胞发生阿尔茨海默样改变。纳米炭黑颗粒与尘土颗粒都可以作为载体吸附其他重金属污染物，是大气污染研究中的理想模型粒子。此外，重金属也是PM中的重要组成部分，铅是PM中的富集金属，丰度较高，而砷、镉的含量虽然较低，但是二者的毒性作用比较大，被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)归为1A类致癌物。有研究证实，铅、砷、镉都可以通过氧化应激、炎症反应等对血管内皮细胞造成损伤，进而导致内皮功能障碍，促进心血管疾病发生；也可以通过协同作用增加淀粉样蛋白形成，促进AD 发生。AD 的发生发展与血管因素密切相关，往往在AD 早期就会出现脑血管损伤及血脑屏障功能障碍，包括血脑屏障渗透性增加，微血流的改变，内皮细胞功能障碍等，PM会损害血管内皮细胞的血管屏障作用，对AD 的发生发展有促进作用。人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)是体外研究血管功能最常用的一种细胞模型。因此，本研究选用HUVECs 作为研究对象，以炭黑、尘土颗粒及重金属铅、砷、镉作为受试物，探讨PM中各个组分以及不同组分联合暴露对血管内皮细胞的毒性作用大小，为后续分子机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 细胞

永生化的HUVECs 由本实验室分离保存，培养于20%胎牛血清的M199 完全培养基中，置于CO体积分数为5%、37 ℃的细胞培养箱，常规胰酶消化传代培养。

1.1.2 试剂

M199 培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、青霉素&链霉素双联抗生素购自美国Gibco公司；二甲基亚砜购自美国Sigma 公司；三水合醋酸铅、亚砷酸钠、无水氯化镉购自广州艾斯金公司；纳米炭黑颗粒(粒径14 nm，下称炭黑)购自德国Degussa AG 公司，亚利桑那测试尘土颗粒(粒径0～3 μm，主要成分为二氧化硅，下称尘土)购自美国PTI公司；CCK-8检测试剂盒购自东仁化学科技(上海)有限公司。

1.1.3 仪器

CO细胞培养箱购自美国Thermo 公司，倒置显微镜购自德国Leica 公司，分析天平购自德国Sartorius 公司，超声振荡清洗器购自昆山市超声有限公司，涡旋振荡器购自美国SCILOGEX 公司，全自动酶标仪(Elx-800型)购自美国Bio-Tek公司。

1.2 方 法

1.2.1 铅、砷、镉染毒液的配制

将0.076 g 三水合醋酸铅粉末溶于10 mL 超纯水中，配制成20 mmol/L醋酸铅储备液，混匀，0.22 μm 滤器过滤除菌，4 ℃保存；将0.013 g 亚砷酸钠粉末溶于10 mL 超纯水中，配制成10 mmol/L 亚砷酸钠储备液，混匀，0.22 μm 滤器过滤除菌，4 ℃保存；将0.036 g 氯化镉结晶溶于10 mL 超纯水中，配制成20 mmol/L 氯化镉储备液，混匀，0.22 μm 滤器过滤除菌，4 ℃保存。染毒前用含2%胎牛血清的M199完全培养基按实验需求将上述储备液稀释成相应的浓度，立即用于细胞染毒。

1.2.2 炭黑颗粒和尘土颗粒悬浮液配制

实验中使用分析天平称取0.025 g 纳米炭黑颗粒加入50 mL 超纯水中，配制成质量浓度为0.5 mg/mL 的储备液，超声15 min后高压灭菌，4 ℃保存备用；实验中使用分析天平称取2.5 g 尘土颗粒加入50 mL 超纯水中，配制成质量浓度为50 mg/mL 的储备液，超声15 min 后高压灭菌，4 ℃保存备用。染毒前取炭黑颗粒和尘土颗粒储备液涡旋振荡混匀，用含2%胎牛血清的M199完全培养基按实验需求稀释成相应的浓度，立即用于细胞染毒。

1.2.3 细胞生长曲线及倍增时间测定

待状态良好的HUVECs 生长至汇合度为80%～90%时，用0.25%胰酶消化并制成单细胞悬液，按一定倍数稀释细胞悬液，细胞计数板计数。根据细胞计数结果按1×10个/mL接种于24孔板，每孔1 mL，混匀，放置于37 ℃培养箱中培养。以后每隔2 d 更换新鲜培养基。从第2 天开始，每隔24 h取出孔板，随机选择3个孔，用胰酶消化并制备单细胞悬液，计算每孔细胞数量，连续计数7 d，制成细胞生长曲线。细胞计数公式为：

式中，

t

表示培养时间(h)，

n

表示首次计数获得的细胞数，

n

表示培养

t

时间后(一般情况下是细胞在对数生长期的终点时)的细胞计数。

1.2.4 试验分组和处理

分别用炭黑、尘土、醋酸铅、亚砷酸钠、氯化镉对细胞进行染毒。进行剂量研究时，炭黑的浓度分别为0、5、10、20、40、80、160 μg/mL，尘土的浓度分别为0、2.5、5、10、20、40、80、160 μg/mL，醋酸铅的浓度分别为0、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μmol/L，亚砷酸钠的浓度分别为0、5、10、20、40、80、160 μmol/L，氯化镉的浓度分别为0、5、10、20、40、80、160 μmol/L。染毒时间均为24 h。进行联合染毒时，选择细胞存活率为80%的剂量进行试验。故炭黑选用的浓度为5 μg/mL，分别与50 μmol/L 醋酸铅、5 μmol/L 亚砷酸钠、5 μmol/L 氯化镉进行联合染毒；尘土选用的浓度为20 μg/mL，分别与 50 μmol/L 醋酸铅、5 μmol/L 亚砷酸钠、5 μmol/L氯化镉进行联合染毒。同时根据在PM中各组分的实际质量占比，选取炭黑的浓度为5 μg/mL，按

m

∶

m

=1∶50，

m

∶

m

=1∶100，

m

∶

m

=1∶500 进行两者联合染毒，以及按

m

∶

m

∶

m

∶

m

=10∶5∶1∶500比例进行四者联合染毒。选取尘土的浓度为20 μg/mL，按

m

∶

m

=1∶50，

m

∶

m

=1∶100，

m

∶

m

=1∶500 进行两者联合染毒，以及按

m

∶

m

∶

m

∶

m

=10∶5∶1∶500比例进行四者联合染毒。染毒时间为24 h。

1.2.5 CCK-8 法检测受试物对细胞存活率的影响

取对数生长期的细胞，按每孔1×10个接种于96 孔板中，加入M199 完全培养基，放置于37 ℃、CO体积分数为5%的细胞培养箱中培养。待细胞贴壁生长至汇合度为70%～80%时，给予上述不同受试物的不同浓度进行染毒，染毒24 h后，吸掉染毒液，用PBS冲洗2 遍，每孔加入 90 μL 的培养基和 10 μL 的 CCK-8 溶液，放入37 ℃、5% CO细胞培养箱中孵育4 h，然后用全自动酶标仪测定各孔的吸光度

D

(450)值和

D

(630)值(计算时先扣除参比波长630 nm 处的吸光度值)，每个处理组设3个平行孔，另设阴性对照和空白调零孔。采用以下公式计算细胞存活率和抑制率，并计算每种受试物对HUVECs 的半数抑制浓度(median inhibition concentration，IC)。

2 结 果

2.1 HUVECs 生长曲线绘制及其细胞群体倍增时间的测定

以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制HUVECs 生长曲线，如图1 所示。从图中可以看出，细胞在接种后最初2 d 处于生长潜伏期，在第3 天进入生长对数期，生长增殖迅速，倍增时间约为32 h，培养至第6 天细胞数达到峰值，未出现明显的生长平台期，第7天细胞数减少，进入衰减期。

图1 HUVECs生长曲线

2.2 不同受试物单独染毒时对细胞存活率的影响及IC50的测定

2.2.1 纳米炭黑颗粒对HUVECs 存活的影响

用不同浓度0、5、10、20、40、80、160 μg/mL 炭黑处理细胞24 h 后，使用CCK-8 试剂盒检测细胞存活抑制情况。结果如图2A 所示，与空白对照组相比，不同浓度组细胞存活率均降低，差异有统计学意义(

P

＜0.05)，且随着染毒浓度升高，细胞存活率也呈逐渐降低的趋势(

F

=224.98，

P

＜0.05)，说明炭黑会对细胞产生一定的毒作用，具有细胞毒性效应，计算得出炭黑对HUVECs的IC为16 μg/mL。

2.2.2 尘土颗粒对HUVECs 存活的影响

用不同浓度0、2.5、5、10、20、40、80、160 μg/mL尘土处理细胞24 h 后，使用CCK-8 试剂盒检测细胞存活抑制情况。结果如图2B所示，随着染毒浓度的增加，细胞存活率总体呈下降趋势(

F

=307.33，

P

＜0.05)。与对照组相比，尘土在2.5 μg/mL 浓度时，细胞存活率为(102.34±1.01)%，差异无统计学意义(

P

＞0.05)；细胞存活率自20 μg/mL 组开始明显下降，差异均有统计学意义(

P

＜0.05)。而且由本实验结果可知当尘土浓度低于20 μg/mL时，处理组相比于对照组HUVECs的存活率仍保持在80%左右，提示尘土在低浓度(2.5、5、10、20 μg/mL)对细胞存活率的影响较小，即产生的细胞毒性较低；当尘土浓度逐渐升高，高于20 μg/mL时，对细胞存活率的影响也逐渐增大，具有一定的细胞毒性效应，计算得出尘土对HUVECs 的IC为110 μg/mL。

2.2.3 不同浓度醋酸铅对HUVECs 存活的影响

用不同浓度 0、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μmol/L 醋酸铅处理细胞24 h 后，结果如图2C 所示，与对照组相比，醋酸铅浓度为6.25 μmol/L 时，细胞存活率为(108.88±7.05)%，差异无统计学意义(

P

＞0.05)；浓度为12.5 μmol/L 时，细胞存活率明显上升，差异具有统计学意义(

P

＜0.05)。醋酸铅浓度为25、50 μmol/L 时，细胞未出现明显死亡；而细胞存活率自100 μmol/L组开始随着染毒浓度升高而逐渐下降，差异均具有统计学意义(

P

＜0.05)。总体来讲，随着铅染毒浓度的升高，细胞存活率呈现先升高后降低的趋势(

F

=552.38，

P

＜0.05)，计算得出醋酸铅对HUVECs细胞的IC为184 μmol/L。

2.2.4 不同浓度亚砷酸钠对HUVECs 存活的影响

用不同浓度0、5、10、20、40、80、160 μmol/L亚砷酸钠处理细胞24 h 后，结果如图2D 所示，细胞存活率呈浓度依赖式降低。与对照组相比，细胞存活率自5 μmol/L 组开始明显下降，差异均有统计学意义(

P

＜0.05)。说明亚砷酸钠会对细胞产生一定的毒作用，且细胞存活率随着染毒浓度升高而呈现下降趋势(

F

=237.98，

P

＜0.05)，计算得出亚砷酸钠对 HUVECs 的IC为15 μmol/L。

2.2.5 不同浓度氯化镉对HUVECs 存活的影响

用不同浓度0、5、10、20、40、80、160 μmol/L亚砷酸钠处理细胞24 h 后，结果如图2E 所示，结果与亚砷酸钠一致，与对照组相比，细胞存活率均下降，差异具有统计学意义(

P

＜0.05)，且随着氯化镉染毒浓度的升高，细胞存活率有下降的趋势(

F

=276.15，

P

＜0.05)。说明氯化镉同样具有细胞毒性，计算得出氯化镉对HUVECs的IC为14 μmol/L。

图2 不同受试物染毒24 h对HUVECs存活率的影响

2.3 不同受试物联合染毒对细胞存活率的影响

2.3.1 炭黑颗粒与铅、砷、镉联合染毒对细胞存活率的影响

根据2.2 的结果，实验选用细胞存活率为80%的染毒浓度，炭黑为5 μg/mL，分别与50 μmol/L醋酸铅、5 μmol/L亚砷酸钠和5 μmol/L氯化镉进行联合染毒。处理细胞24 h 后，结果如图3A 所示，与对照组相比，炭黑单独染毒与联合染毒时，细胞存活率均有所下降(

P

＜0.05)，且炭黑与铅、砷、镉联合作用时细胞存活率下降幅度比炭黑单独染毒时大，差异具有统计学意义(

P

＜0.05)。此外，根据PM中各组分的实际质量占比来确定联合染毒浓度。PM中元素碳(elemental carbon，EC)的质量占比为3%～10%，铅的质量占比为0.05%～0.20%，砷的质量占比为0.01%～0.05%，镉的质量占比为0.005%～0.01%。故炭黑的浓度仍为5 μg/mL，根据以上比例，确定铅与炭黑的质量比为1∶50(铅的浓度为0.5 μmol/L)，砷与炭黑的质量比为1∶100(砷的浓度为0.67 μmol/L)，镉与炭黑的质量比为1∶500(镉的浓度为0.1 μmol/L)，铅、砷、镉混合与炭黑的质量比为

m

∶

m

∶

m

∶

m

=10∶5∶1∶500。处理细胞24 h后，结果如图3B所示，与对照组相比，单独染毒与联合染毒时细胞存活率均下降(

P

＜0.05)，炭黑与铅(

m

∶

m

=50∶1)联合染毒组和炭黑与砷(

m

∶

m

=100∶1)联合染毒组细胞存活率与炭黑单独染毒组相比差异无统计学意义(

P

＞0.05)，炭黑与镉(

m

∶

m

=500∶1)联合染毒组细胞存活率下降幅度比炭黑单独染毒组大，炭黑与铅砷镉联合染毒组(

m

∶

m

∶

m

∶

m

=10∶5∶1∶500)细胞存活率大幅降低，差异均有统计学意义(

P

＜0.05)。

图3 炭黑和醋酸铅、亚砷酸钠、氯化镉联合染毒24 h对HUVECs存活率的影响

2.3.2 尘土颗粒与铅、砷、镉联合染毒对细胞存活率的影响

根据2.2 的结果，实验选用细胞存活率为80%的染毒浓度，尘土染毒浓度为20 μg/mL，分别与50 μmol/L 醋酸铅、5 μmol/L 亚砷酸钠和5 μmol/L 氯化镉进行联合染毒。处理细胞24 h 后，结果如图4A所示，与对照组相比，尘土单独染毒与联合染毒时，细胞存活率均有所下降(

P

＜0.05)，且尘土与铅、砷、镉联合作用时细胞存活率下降幅度比尘土单独染毒时大，差异具有统计学意义(

P

＜0.05)。此外，根据PM中各组分的实际占比来确定联合染毒剂量。尘土染毒浓度为20 μg/mL，铅与尘土的质量比为1∶50(铅的浓度为2 μmol/L)，砷与尘土的质量比为1∶100(砷的浓度为2.67 μmol/L)，镉与尘土的质量比为1∶500(镉的浓度为0.35 μmol/L)，铅砷镉混合与尘土的质量比为

m

∶

m

∶

m

∶

m

=10∶5∶1∶500。处理细胞24 h后，结果如图4B所示，与对照组相比，尘土单独染毒与联合染毒时细胞存活率均下降(

P

＜0.05)，尘土与铅(

m

∶

m

=50∶1)联合染毒组和尘土与镉(

m

∶

m

=500∶1)联合染毒组细胞存活率与尘土组相比无显著差异(

P

＞0.05)，尘土与砷(

m

∶

m

=100∶1)联合染毒组细胞存活率下降幅度比尘土组大，尘土与铅砷镉联合染毒组(

m

∶

m

∶

m

∶

m

=10∶5∶1∶500)细胞存活率大幅降低，差异均有统计学意义(

P

＜0.05)。

图4 尘土和醋酸铅、亚砷酸钠、氯化镉联合染毒24 h对HUVECs存活率的影响

2.4 交互作用分析

2.4.1 炭黑与铅、砷、镉交互作用对细胞存活率的影响

在炭黑与醋酸铅、亚砷酸钠、氯化镉交互作用的研究中，采用2×2 析因设计进行分析。结果如表1 所示，炭黑与醋酸铅之间无交互作用(

P

＞0.05)，炭黑与亚砷酸钠、炭黑与氯化镉之间均具有交互作用(

P

＜0.05)。此外，炭黑、亚砷酸钠、氯化镉单独染毒时，细胞存活率分别为(84.90±2.34)%、(68.34±2.65)%、(87.26±2.40)%，而炭黑与亚砷酸钠联合染毒时细胞存活率为(47.85±1.37)%，炭黑与氯化镉联合染毒时细胞存活率为(45.01±5.83)%，联合染毒时细胞存活率显著低于单独染毒时(

P

＜0.05)，说明炭黑与亚砷酸钠、炭黑与氯化镉联合染毒时对细胞毒性作用增强，二者之间表现为协同作用。

表1 炭黑与铅、砷、镉联合染毒析因设计方差分析表

2.4.2 尘土与铅砷镉交互作用对细胞存活率的影响

在尘土与醋酸铅、亚砷酸钠、氯化镉交互作用的研究中，采用2×2 析因设计进行分析。结果如表2 所示，尘土与醋酸铅、尘土与亚砷酸钠、尘土与氯化镉之间均无交互作用(

P

＞0.05)。

3 讨 论

当前空气PM污染仍然是威胁人类健康的主要因素之一，流行病学研究报告表明，环境PM暴露与许多心血管疾病以及神经退行性病变如AD 密切相关。PM的化学组成十分复杂，其中炭黑和尘土颗粒是PM中的重要核心粒子，而且也被作为模型颗粒物而广泛应用于大气研究。重金属元素也是PM的重要组成部分，一般占大气颗粒物的0.3%～5.0%，虽然含量不高，但是由于重金属不可降解性、生物富集性等特点，仍然会对人体产生较大危害。有学者对我国部分城市的PM中重金属含量进行分析，发现各元素平均浓度从高到低的顺序为 Zn＞Pb＞Cu＞Cr＞Ni＞As＞Cd。由此可见，Pb在PM中的含量较高，而As和Cd 的含量较低，但是这两种元素的毒性作用较大，已经被IARC 归类为1A 类致癌物。因此，本研究从PM不同组分入手，探讨颗粒物质和重金属元素对HUVECs的单独毒性作用及联合毒性作用。

表2 尘土与铅、砷、镉联合染毒析因设计方差分析表

目前来说，检测不同受试物对细胞的毒性大小，通常用的几种方法有噻唑蓝(methylthiazolydiphenyltetrazolium bromide，MTT)比色法和 CCK-8 法。MTT比色法具有简单、经济的特点被广泛应用，但是由于其还原性甲臜产物不溶于水，需要用二甲基亚砜(DMSO)溶解后才能进行检测，增加了操作流程，也使结果准确性受到一定影响。而CCK-8法是近年来一种新的检测方法，它利用水溶性四唑盐WST-8在电子载体存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臜染料，可直接进行测定，实验误差小，是一种高灵敏度的检测方法。此外，如果样品中有影响测定的物质如炭黑和尘土颗粒，可以通过设定参比波长(600 nm 以上)，将其吸光度值扣除，以避免由于样品浑浊所带来的吸收。也有研究者将两种方法进行实验对比，认为CCK-8法更为简便、灵敏，明显优于MTT法。

研究发现，用不同受试物对细胞进行单独染毒时，细胞存活率会随着染毒剂量的升高而呈下降趋势，并且通过比较两种颗粒物质的IC值，炭黑的IC(16 μg/mL)小于尘土的 IC(110 μg/mL)，说明炭黑对HUVECs 产生的毒性较大，而本次实验中使用的炭黑是纳米级的颗粒物，尘土是微米级的颗粒物，这也从侧面反映出颗粒物的尺寸越小，对细胞的毒性作用越大。也有学者通过对不同粒径的二氧化硅对HUVECs损伤的比较，得出纳米二氧化硅比微米二氧化硅的细胞毒性大的结论，本实验结果也与之相符。对于重金属铅、砷、镉对细胞毒性大小的研究，比较这三者的IC发现，铅的细胞毒性是最小的，镉的细胞毒性最大。

然而在以往的研究中，往往只关注于PM整体效应或只针对某一种组分导致的效应，缺乏对于PM中不同组分联合作用的研究。毒理学上将两种或两种以上的化学物质同时或先后作用于生物体引起的毒作用称为联合作用。联合作用主要分为相加作用、独立作用、协同作用和拮抗作用4 类。目前关于联合作用的评价方法有许多，例如等效线图法、联合作用系数法等，但是在应用过程会受到一定限制，因此有研究者开始用统计学方法研究化学混合物的联合毒性。其中，析因设计是一种多因素的交叉分组设计，要求将各个因素的水平进行全面组合，这样可以对各种组合的交互作用估计得较为准确。最常用的两因子或三因子析因设计。本研究采用2×2 析因设计对炭黑、尘土和铅、砷、镉的联合作用进行分析，结果显示，炭黑、尘土分别与重金属联合染毒时，细胞存活率显著低于其单独染毒时的细胞存活率；而且炭黑与亚砷酸钠、炭黑与氯化镉之间存在交互作用，具体表现为协同作用，即两者的综合效应大于单个效应的总和。同时，根据各组分在PM中的实际质量占比按比例进行染毒，发现炭黑与铅、砷、镉三者联合染毒时及尘土与铅、砷、镉三者混合染毒时，细胞存活率显著低于炭黑、尘土单独染毒时的细胞存活率。

本研究对于炭黑、尘土与铅、砷、镉的联合毒性作用做了初步的探索，发现PM中不同组分都可以对血管内皮细胞产生毒性作用，纳米炭黑颗粒的细胞毒性作用比尘土颗粒大，铅、砷、镉对细胞的毒性作用大小为氯化镉＞亚砷酸钠＞醋酸铅。炭黑、尘土分别与铅、砷、镉3 种金属联合染毒时比单独染毒时细胞毒性更大，且炭黑与亚砷酸钠、氯化镉之间存在交互作用，具体表现为协同作用，但是尘土与3 种金属的联合暴露比炭黑与3 种金属的联合暴露细胞毒性更大。本研究结果提示，应该重点关注炭黑来源的PM污染源对血管损伤及相关疾病的影响，尤其当PM中砷、镉与炭黑联合暴露时，对血管内皮损伤更加严重。