γ-神经突触核蛋白在电针改善大脑中动脉闭塞模型大鼠认知功能中的作用*

徐芳媛 ，罗来 ，许金森 ，潘晓华 ，黄倩茹 ，万隆 ，朱佳敏

1 福建中医药大学针灸学院 福建福州 350108

2 福建省中医药科学院 福建福州 350003

3 福建省经络感传重点实验室 福建福州 350003

脑卒中是神经系统中最为常见和多发的疾病，而在脑卒中患者中，发病3个月内的大多以肢体功能障碍为主要表现[1]，因此对患者的的日常生活和生存质量造成了巨大的影响。针灸治疗脑卒中的水平已经日趋成熟，电针已经成为针灸临床中广泛应用的医疗器材[2]。运用电针治疗是脑卒中的一个重要治疗手段，在既往的研究中也取得了良好的效果[3]。γ-神经突触核蛋白（SNCG）主要分布在大脑的突触前末端和周围神经系统，它是具有高保守性和低分子量的可溶性蛋白[4]。SNCG在胚胎和新生儿脑组织中不表达，但会随着年龄的增长而不断增加，而三叉神经节在胚胎发育的10～11d后终止并逐渐成熟[5]。在神经系统中，它可能参与突触功能和可塑性的调节，并且与神经生长和神经网络的稳定性有关[6]。因此，本研究通过观察电针对大脑中动脉闭塞模型（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠的脑卒中症状的影响，和缺血侧海马中SNCG 蛋白含量变化来探讨电针治疗脑卒中的机制，为电针治疗脑卒中提供理论依据。

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物 选用成年的SD雄性大鼠共18只，均由福建医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（沪）2017-0005，体质量（300±20）g，大鼠等级：清洁级。每笼6只大鼠，均自由进食及饮水，适应性饲养1周。饲养条件：温度（22±2）℃，湿度（55±15）%，12h明暗交替，自由进食与饮水。实验过程中均严格按照国际动物保护及使用指南的规定进行。

1.2 主要实验器械与试剂 华佗牌30号0.5寸不锈钢毫针（中国上海） 、SDZ-II型华佗牌电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）、小动物呼吸麻醉系统（深圳瑞沃德生命科技公司，R407），L3800号大鼠用MCAO线栓（广州佳灵生物技术有限公司）、洁净工作台（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、DK-8D型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）、ViiA 7 Realtime PCR System 荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）、酶标仪（Thermo）、2X PCR master mix试剂盒（Arraystar）、Primer试剂盒（英骏生物技术有限公司）、细胞及组织总蛋白抽提试剂盒（KangChen，KC-415）、BCA 蛋白质定量试剂盒（KangChen，KC-430）。

2 分组与造模

将18只大鼠按随机数字表法随机均分为电针组、模型组、假手术组。电针组和模型组参考Longa改良线栓法[7]，在大鼠左侧行MCAO手术，具体操作方法为[8]：①大鼠术前禁食不禁水12 h；②将大鼠投入透明麻醉诱导盒中，开启异氟烷流量并调至500 ml/min，浓度调至5 %，持续1min，待大鼠呼吸平稳缓慢，缩爪反射消失后，将大鼠取出戴上呼吸面罩，并根据术中大鼠对手术刺激的反应，适当调节浓度、流量以维持麻醉深度；③将麻醉后大鼠四肢固定仰卧于手术板上，剔除左侧颈部毛发，用酒精对暴露皮肤进行消毒，于颈部前正中线切开皮肤，钝性分离左侧颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）；④使用缝合线在左侧ECA的远心端打一个死结，结扎ECA，继而使用动脉夹夹闭ICA、ECA的远心端；双极电凝器电凝ECA的1个分支，避免在剪断时失血；在ECA距CCA的分叉1 cm处剪开1个小口，将线栓缓慢沿ECA插入ICA，在剪口处向下约2 mm处使用缝合线打一活结略微绑紧ECA，之后剪断ECA并将残端反折以使线栓插入ICA，遇到轻微阻力时即停止插入，进线深度为18～22 mm，再将ECA残端的活结打死防止线栓脱出；⑤缝和伤口并消毒，2 h后轻柔回抽线栓至CCA分叉处，减去线栓的体外部分，实现再灌注损伤；⑥假手术组只将颈部皮肤剪开，钝性分离CCA、ICA、ECA后即缝合，不予结扎和插线；⑦保持室温为25℃左右，直至大鼠苏醒。

3 动物造模后筛选

再灌注 2h，大鼠完全苏醒后，对所有大鼠进行提尾实验[9]。将大鼠尾巴提起后，右前肢屈曲，表明造模成功，进入下一阶段实验；若大鼠能够正常活动、进食，或不能自发行走意识朦胧或丧失则为造模失败，退出实验。

4 干预措施

电针组参考《实验针灸学》[10]选取大鼠“神庭”“百会”穴，选用华佗牌30号0.5寸不锈钢毫针沿头部向上斜刺0.2～0.3 cm，连接SDZ-II电针仪，以针体轻微抖动且大鼠耐受为度，选取疏密波，频率为2～10 Hz，每次干预时间为20 min，于大鼠术后24 h开始进行干预，连续7日。模型组和假手术组行同等条件抓取后回笼，不予治疗。

5 标本采集与检测

5.1 平衡木实验 在手术后第1，3，7天对3组大鼠进行平衡木实验，判断神经损伤情况[11]。将大鼠放置在1根宽1.5cm、长30cm、高于地面30cm的木条上，观察它们的行为表现。实验前1周对各组大鼠进行训练：每日8点和17点各训练1次，每次10 min，以大鼠能顺利在平横木上保持稳定为标准。造模成功后分别在第1，3，7天对每组大鼠进行平衡木实验并评分[12]，评分为0～6分，0分：大鼠在平衡木上能够保持平衡稳定；1分：大鼠在平衡木上需要抓紧平衡木边缘才能保持平衡稳定；2分：大鼠需抓紧平衡木但是同时有一只脚落下才能保持平衡稳定；3分：大鼠需要抓紧平衡木但是同时有两只脚落下，或在平衡木上旋转，能够坚持在平衡木上的时间≥60s；4分：大鼠试图在平衡木上保持平衡，但落下，同时能够坚持在平衡木上的时间≥40s；5分：大鼠试图在平衡木上保持平衡，但落下，同时能够坚持在平衡木上的时间≥20s；6分：落下，没有试图保持平衡或抓住平衡木，能够坚持在平衡木上的时间≤20s。评分越高神经损伤越严重。

5.2 q-PCR检测脑组织SNCG mRNA表达 实验结束后，取出大鼠左侧海马，放入RNA的保存液中，继而放入-80 ℃冰箱里面备用。参照Trizol一步法说明提取总RNA[13]，具体步骤为：①每50～100mg组织样品，加入1ml的Trizol试剂，用电动匀浆器进行匀浆；②每1ml的Trizol试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，离心15min；③离心后将水相转移到新离心管中，水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀沉淀后于离心10min；④移去上清液，加入75%乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，离心5min；⑤去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5～10min；⑥溶解RNA，获得的RNA溶液保存于-70°C；⑦配制退火混合物；⑧短暂离心后，在离心管中依次加入RT反应液；⑨移液枪轻轻吸打几次混合均匀，50℃温育60min，70℃ 温育15min使酶失活，cDNA置冰浴待用或-20℃保存。引物序列见表1。q-PCR反应体系：反应总体积10 μL，其中上下游引物各0.3 μL，cDNA 2 μL，qPCRmaster-Mix 5 μL，ddH2O 2.4 μL。反应条件：95℃，10min；40个PCR循环（95℃，10秒；60℃，60秒（收集荧光））。每个标本均设复孔，重复3次，获得SNCG mRNA基因Ct值，以GAPDH为内参，按照2-△△Ct方法处理数据。其中，△Ct=（目的基因平均Ct-内参平均Ct）；△△Ct=（待测样品中目的基因△Ct-参照样品中目的基因△Ct），所有数据均与内参比较。

5.3 免疫蛋白印记（WB）检测脑组织中SNCG的蛋白的表达 制备蛋白样品[14]，具体步骤为：①将细胞提前种植在6cm平皿中，待细胞长至70%～80%时取用，加入2mlPBS洗涤2遍，彻底吸净PBS残液；②加入细胞裂解液 150μl，将细胞刮下，放在冰上裂解20min，然后将裂解液移至EP管中，离心20min；③将上清液移入新的EP管中，即为所需蛋白样品；④运用 Bradford 法测定蛋白样品的浓度；⑤向其余蛋白样品中加入其1/4体积的5X上样缓冲液，混匀，煮沸10min，存于-20℃待用。蛋白质电泳的具体步骤为：①配胶：配制8%的下层胶和6%的上层胶；②上样电泳：每个蛋白泳道上样量10μl，电泳时间为45min，恒定电流25m；③转膜：电泳完成后将蛋白质转移到NC膜上，转膜时间为45min，电压恒定20V；④立春红染色证实转膜情况，标记标准蛋白分子量所在位置，去离子水洗 2 遍；⑤PBST 配制的 5%的脱脂牛奶室温封闭1h；⑥PBST 配制 2.5%脱脂牛奶稀释一抗（1：500）封闭条带置于摇床，4℃冰箱过夜；⑦PBST洗3min×5次；⑧PBST 配制 2.5%脱脂牛奶稀释辣根酶标记的二抗（1：2000），室温封闭 1h，PBST 洗 3min×5次；⑨ ECL 显影。

6 数据处理

结 果

1 平衡木实验评分

造模手术24 h后，电针组的平衡木实验评分高于假手术组（P=0.002），模型组的平衡木实验评分高于假手术组（P=0.002），电针组和模型组之间无明显差异（P＞0.05）；术后3d电针组评分和假手术组存在差异（P=0.009），但电针组低于模型组评分（P=0.009），模型组评分高于假手术组（P=0.001）；术后7 d后电针组评分高于假手术组，两者之间存在差异（P=0.035），电针组明显低于模型组（P=0.003），模型组评分高于假手术组（P=0.001），3组之间存在明显差异，见表2。

表1 引物序列

表2 3组大鼠神经功能缺损评分比较（）

表2 3组大鼠神经功能缺损评分比较（）

组别 例数 术后1d 术后3d 术后7d电针组 6 5.11±0.54 3.23±0.51 2.23±0.42模型组 6 5.23±0.69 5.89±0.76 5.92±0.02假手术组 6 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00

2 SNCG在海马中的表达

电针组较假手术组而言，SNCG mRNA表达量明显升高（P=0.027）；模型组较假手术组而言，SNCG mRNA表达量明显降低（P=0.023），电针组和模型组之间存在明显差异（P=0.004），见表3。

表3 3组大鼠海马中SNCG mRNA的表达（）

表3 3组大鼠海马中SNCG mRNA的表达（）

组别 只数 SNCG mRNA电针组 6 0.05±0.003模型组 6 0.01±0.009假手术组 6 0.03±0.003

3 Western blot 检测 SNCG在脑组织中蛋白的表达

电针组较假手术组而言，SNCG 蛋白的表达量无明显差异（P=0.213）；模型组较假手术组而言，SNCG蛋白的表达量明显降低（P=0.002），电针组和模型组之间存在明显差异（P=0.007），见表4。

表4 3组大鼠海马中SNCG 蛋白的表达（）

表4 3组大鼠海马中SNCG 蛋白的表达（）

组别 只数 SNCG mRNA电针组 6 0.90±0.005模型组 6 0.71±0.008假手术组 6 0.96±0.009

讨 论

运动功能障碍是脑卒中的主要并发症，脑卒中患者出现运动障碍以及神经障碍等症状的概率为80%[15]。脑卒中对患者的正常生活与工作均造成不同程度的影响，并且在疾病不断的发展过程中，导致患者出现偏瘫的病症，甚至导致患者的死亡[16]，因此，脑卒中疾病的危险性与死亡率较高。

平衡木实验是较为经典的检测神经功能缺损的指标，可以直观的反应大鼠大脑与肢体当前的协调配合控制能力[17]。本研究结果显示，对脑卒中大鼠进行电针“神庭”“百会”6周的治疗后，其平衡木实验评分较模型组有明显的改善，并且3组之间存在统计学差异，可以认为电针神庭、百会对于MCAO大鼠的神经功能缺损有明显的改善作用。

近年来，功能基因组学技术已经广泛运用于动植物生理生化、肿瘤与干细胞、脑及中医药研究等领域，并促进了相关领域的发展[18-19]。全转录组测序和蛋白组测序分析结果显示，SNCG mRNA及其编码的神经核蛋白-γ在假手术组中均为低表达，在模型组显著上调，电针显著抑制其高表达量，SNCG mRNA及其编码的神经核蛋白-γ在3组动物中的表达趋势一致，表现为在转录水平的有效调节[20]。

通过比较3组大鼠海马中SNCG mRNA的表达量，可以发现电针组较假手术组有明显的升高，而模型组较假手术组有明显的降低。研究发现MCAO大鼠海马中SNCG的表达量比假手术组要低，而通过电针治疗后，SNCG会明显的升高，可以认为SNCG与大鼠认知功能之间存在关系。

通过比较3组大鼠海马中SNCG 蛋白的表达量，可以发现电针组较模型组有明显上升，模型组较假手术组有明显的降低。研究表明MCAO大鼠海马中SNCG蛋白的表达量比假手术组要低，而通过电针治疗后，SNCG的蛋白表达会明显的升高，可以认为SNCG蛋白表达量与大鼠的认知功能之间存在联系。

在既往的研究中，已经有大量实验论证了SNCG对肿瘤细胞之间存在关联性，却极少文章有提到与脑卒中的联系[21]。SNCG在胚胎和新生儿脑组织中不表达，但会随着年龄的增长而不断增加，而随着它的增长，我们的脑功能不断健全完善，使我们从婴幼儿成长为脑功能健全的成年人，而随着年龄的增加，SNCG在不断的减少，导致脑卒中在中老年群体中发病最明显。在本次实验中，经过电针干预后，电针组大鼠海马中SNCG mRNA的表达较假手术组明显升高，模型组大鼠海马中SNCG mRNA的表达较假手术组明显降低。结合本实验大鼠神经功能评分结果，我们认为造模后大鼠海马组织中SNCG mRNA的表达降低通过某种途径促使神经功能评分升高，电针干预后促进了SNCG mRNA的表达，增加了SNCG的释放，降低神经功能评价，达到治疗的目的，因此SNCG可能是治疗血管性认知障碍的潜在靶点之一。经过电针干预后，电针组大鼠海马中SNCG对比的表达较模型组明显升高，模型组大鼠海马中SNCG 蛋白的表达较假手术组明显降低。进一步论证了电针能有效提高SNCG蛋白的表达，深入明确了SNCG与血管性认知障碍之间的联系，但由于脑卒中病理机制的复杂性和电针干预效果的多靶点特征，对于电针改善脑卒中症状的机制还有待进一步研究。