DNA条形码在我国常见鱼肉样品鉴定中的应用

黄曼虹，熊 雄，袁方颖，陆利霞,2，熊晓辉,2

(1.南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 211800；2.江苏省食品安全快速检测公共技术服务中心， 江苏 南京 211800)

水产品种类繁多，营养价值和经济价值千差万别。为了追求利益的最大化，国际市场上各种水产品以次充好，假冒替代的现象时有发生。据统计，2010—2015年，世界水产品平均物种错误标签率达到30%[1]。

非法的经济获益是水产品掺假的最大诱因。Miller等[2]根据爱尔兰当地市场价格，估算鳕鱼制品因物种掺假每年可产生非法收益40万～50万英镑。而除了经济损失，水产品掺假也给食品安全带来巨大的风险隐患。如Armani等[3]从预包装鱿鱼片中鉴定出有毒的河豚鱼品种。

我国是世界水产品消费大国。据《中国统计年鉴》统计：2017年，我国人均水产品消费量达到11.5 kg，比2013年增加了10.58%。其中，城乡居民人均水产品消费量分别达到了14.8和7.4 kg，比2013年分别增加了5.71%和12.12%。在水产品消费量增长的同时，人们对水产品的质量安全也提出了更高的要求，其中一个重要的方面就是对水产类原料的生物种属进行准确的标识和鉴定[4]。然而，由于缺乏对一些水产类物种命名的统一标准以及不少商贩缺乏专业的水产类物种分类知识，我国市场上水产品物种掺假现象不断被曝光，如“真假鳕鱼”[5]和“真假三文鱼”[6]等。

传统的形态学特征法需要鉴定者拥有良好的形态学鉴定知识，但鉴定者不能通过该法对水产品加工制品进行准确鉴定，因此，该法不能满足水产品掺假检测的需求。基于DNA的分子生物学方法具有高效、特异、灵敏、快速的特点，在水产品鉴别方面已经展现出巨大的潜力。其中，DNA条形码(DNA barcoding)技术是应用最广泛的一种，其基本原理是利用一段较短的DNA标准序列的多态性来实现快速、准确的物种鉴定[7]。对动物而言，该标准序列一般为线粒体COⅠ基因5′端的一段长约650 bp的片段。该技术对鉴定者的经验和专业知识背景要求较低，为物种鉴定提供了新的手段，已被广泛应用于水产品品种鉴定[5,8-9]。

本研究中，笔者对江苏市场采集的127份(42种鱼肉)样品进行DNA提取、扩增、测序和序列分析，分析其标签标注的准确性，以期为水产品市场监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 鱼肉样品

1.1.2 试剂

10×Reaction Buffer、BioReady rTaqDNA聚合酶、dNTP Mixture，日本BioFlux株式会社；6×Loading Buffer、DL1000 DNA Marker，宝日医生物技术有限公司；琼脂糖凝胶，西班牙Biowest公司；GelRedTM核酸凝胶染料，美国Biotium公司；蛋白酶K，BBI生命科学有限公司；引物合成，金斯瑞生物科技有限公司。

1.1.3 仪器与设备

BioPhotometer D30型核酸蛋白测定仪，德国Eppendorf公司；Laborzentrifugen高速离心机，德国Sigma公司；Life Express梯度PCR仪，中国杭州博日科技有限公司；Bio-Rad ChemiDoc MP凝胶成像系统，伯乐生命医学产品(上海)有限公司；JY300C型凝胶电泳仪、JY-SPFT型电泳槽，北京君意东方电泳设备有限公司；GWA-UNI-F40型纯水/超纯水器，北京普析通用仪器有限责任公司；MS-100型恒温混匀仪，杭州奥盛仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

DNA提取参照Armani等[10]的盐析法，操作步骤如下：用灭菌的剪刀取鱼背部肌肉50 mg于1.5 mL的离心管中，分别加入200 μL的裂解缓冲液(质量分数2% SDS，0.1 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA，0.5 mol/L Tris，pH 8.0)、200 μL NaH2PO4和10 μL的蛋白酶K，置于恒温混匀仪中1 500 r/min、65 ℃加热60 min。然后，离心管14 000g离心5 min，取上清液至新的1.5 mL离心管中，并加入0.5倍体积的乙酸钠(4 mol/L，pH 8.2)，混匀后14 000g离心5 min，取上清液至新的离心管并重复该步骤。最后，向离心管中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后静置10 min，14 000g离心10 min去上清液，并用70%乙醇和100%无水乙醇分别清洗DNA 2次和1次，65 ℃烘箱烘干。每个样品设2个平行。

表1 样品信息

用核酸蛋白测定仪测定DNA在230、260和280 nm处吸光值，并分别计算其浓度和纯度。用1%琼脂糖凝胶进行总DNA电泳。所有DNA样品于-20 ℃保藏。

本报讯日前，农业农村部决定在部分具备条件的县（市、区）开展农民专业合作社质量提升整县推进试点。《农业农村部办公厅关于组织申报农民专业合作社质量提升整县推进试点有关事项的通知》提出，试点县（市、区）农民合作社规模和农户覆盖面明显扩大，示范社建设深入实施。合作社运行管理制度健全，组织机构运转有效，民主管理水平不断提高，财务社务管理公开透明，经济实力、发展活力和带动能力明显增强，成员权益得到切实保障。力争试点县（市、区）农民专业合作社年报公示率达80%以上，80%以上的合作社建立完备的成员账户、实行社务公开、依法进行盈余分配。试点为期2年，自2018年8月至2020年底。

1.2.2 PCR扩增

采用通用引物扩增序列，引物序列见表2。

表2 扩增引物序列

PCR反应体系为20 μL：10×Reaction Buffer(含有15 mmol/L MgCl2)2 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)1 μL，BioReady rTaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，引物(10 μmol/L)各0.25 μL，DNA模板1 μL，灭菌超纯水12.5 μL。

PCR反应程序：94 ℃预变性2 min，35个循环(94 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min)，72 ℃延伸10 min。

1.2.3 PCR产物测序与序列分析

PCR扩增完成后，以2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，挑选扩增成功且条带单一的产物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行双向测序。

采用BioEdit软件对测序所得的峰图进行校对拼接，去除正反向引物和低质量的序列后，提交至BOLD(http://boldsystems.org/index.php/IDS_OpenId Engine)和GenBank(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)数据库比对分析。数据库中与未知序列相似度≥98%的品种即为目标物种[12]。根据序列相似度比较的结果(相似度≥98%[12])，确认各样品的物种类别。

对于只可鉴定到属的样品，在GenBank中下载对应属的所有序列，并删去重复序列。将下载的序列用来自Handy等[11]的DNA条形码片段在BioEdit软件中比对，去除正反向引物和低质量的序列后，再将所得序列通过MEGA 7.1软件进行基于Kimura 2-parameter(K2P)模型的种内和种间遗传距离分析。

2 结果与讨论

2.1 DNA浓度及质量

所有127份样品均可以成功提取总DNA。DNA的质量浓度为73.19～1 406.83 ng/μL，均值为483.20 ng/μL。所有DNA样品的A260/A280为1.8～2.0。总DNA电泳图显示所有样品均未发生明显降解。

本研究采用的DNA提取方法为改良盐析法[10]，该方法把传统的肌肉组织裂解时间缩短至60 min，并通过NaCl浓度的变化使DNA析出。前人研究结果已证实该方法可以成功从新鲜鱼肉样品、寿司、烤鳕鱼产品以及鱼罐头产品中提取总DNA[5,8-10]。本研究中的所有样品DNA均具有较高浓度和质量，再一次证明该方法的可靠性。

2.2 PCR扩增与测序

对PCR产物进行电泳分析，发现除DNA提取空白和加样空白对照外，所有127份样品DNA均在750 bp左右有单一的目标条带(图1)。所有127份样品均成功测序。去除正反向引物(约88 bp)和低质量的序列后，片段长度为646～653 bp，平均长度为649 bp。

1～22—S1～S22；23—阳性对照；24—阴性对照；M—DL1000 DNA Marker图1 部分样品PCR产物琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Gel electrophoresis of partial PCR products

2.3 序列比对分析

GenBank是美国国家生物技术信息中心(NCBI)建立的DNA序列数据库，可保存所有序列的相关记录。BOLD数据库是保存来自DNA指定区域的条形码片段，旨在建立一个所有真核生物的条形码库，包括鸟类、鱼类和鳞翅类等。物种鉴定时，用BLAST程序对GenBank数据库进行未知序列的同源性搜索，或者将测序获得的条形码序列粘贴到BOLD网站窗口中，数据库中与未知序列相似度≥98%的品种即为目标物种[12]。

GenBank和BOLD数据库比对发现所有样品均可以获得相似度>98%[12]的对应物种(表3)。对于GenBank数据库，样品在种水平和属水平鉴定成功率分别为38.10%(16/42)和40.48%(17/42)；对于BOLD数据库，则对应分别为35.71%(15/42)和47.62%(20/42)，可见BOLD与GenBank数据库在种和属水平鉴定成功率基本相同。综合2个数据库的结果，样品在种和属水平鉴定成功率分别为40.48%(17/42)和50.00%(21/42)，即9.52%(4/42)的样品无法在种属水平进行鉴定，表明DNA条形码技术对我国市场常见鱼肉样品的物种鉴定具有一定的可行性。

其中，GenBank和BOLD均可以准确鉴定至同一物种的有14种样品，分别是小黄鱼(S20～S26，Larimichthyscrocea)、海鲈鱼(S32～S36，Lateolabraxjaponicus)、多宝鱼(S37～S41，Scophthalmusmaximus)、鲜池蛋鱼(S54～S57，Planilizahaematocheila)、刀鲳(S72～S76，Menemaculata)、虎头鲨(S77～S78，Odontobutispotamophila)、黑鱼(S79～S81，Channaargus)、南极犬牙鱼(S112，Dissostichusmawsoni)、加州鲈鱼(S115，Micropterussalmoides)、清江鱼(S118，Ictaluruspunctatus)、鲈鱼(S126，Micropterussalmoides)、黄颡鱼(S127，Tachysurusfulvidraco)、金目鲈鱼(S124，Lateolabraxjaponicus)和红古鱼(S42～S47，Sciaenopsocellatus)。花鲢(S119)和青鳗(S121)在GenBank数据库中比对均可得唯一的物种，分别是Hypophthalmichthynobilis和Congerjaponicus；而在BOLD数据库中比对，花鲢与H.nobilis和H.molitrix的相似度均大于98%，青鳗与C.myriaster和Muraenesoxcinereus的相似度均大于98%。秋刀鱼(S63～S67)在BOLD数据库中比对均可得唯一的物种是Cololabissaira；而在GenBank数据库比对中，其与C.saira、Cololabissp.和Scomberesoxsaurus的相似度均大于98%(表3)。

只能鉴定到属的21种样品分别为野生鲫鱼(S5～S10，Carassius)、刀鱼(S11～S15，Coilia)、金鲳鱼(S27～S31，Trachinotus)、白鲳鱼(S48～S53，Pampus)、青占鱼(S68～S71，Scomber)、鳀鱼(S125，Scomber)、鳜鱼(S82～S83，Siniperca)、太湖银鱼(S90～S99，Neosalanx)、南极冰鱼(S100～S103，Patagonotothen)、冰鱼(S104～S105，Patagonotothen)、带鱼(S122，Trichiurus)、小鱼(S84～S89，Chanodichthys)、白鱼(S123，Chanodichthys)、河豚鱼(S110，Takifugu)、石斑鱼(S116，Epinephelus)、鮰鱼(S117，Tachysurus)、红石斑鱼(S106～S108，Helicolenus)、江鱼(S16～S19，Cirrhinus)、鲫鱼(S1～S4，Cyprinus)、鲤鱼(S109，Cyprinus)和金线鱼(S58～S62，Nemipterus)。红石斑鱼只可在GenBank数据库中鉴定到属，而江鱼、鲫鱼、鲤鱼和金线鱼只可在BOLD数据库中鉴定到属(表3)。

最后，4种样品在GenBank和BOLD数据库均无法鉴定到属，分别为金枪鱼(S111)、巴沙鱼(S113)、鳕鱼(S114)和草鱼(S120)。

事实上，由于BOLD和GenBank数据库均为开放平台，所有研究者均可提交序列，且数据库自身并不会核对提交物种序列，因此，并不是所有提交至数据库的序列都标有对应的物种拉丁学名，有些仅标注属名或科名，甚至只是做一个简单的描述[13]。本研究中，巴沙鱼(S113)在GenBank数据库比对中与Fish environmental sample相似度>98%。类似的问题前人也有报道，如Carvalho等[14]对巴西市场进行研究，发现种水平鉴定成功率为78.4%。可能的原因包括：①相对物种数量而言，数据库中有标准序列的物种数太少；②挑选的COI条形码片段种内种间遗传距离较大，无法满足鉴定相近属间的要求。

2.4 标签真实性评价

食品标签是传递产品信息的重要载体。如何规范食品标签，防止食品欺诈，保护消费者合法权益，已经成为保障食品安全的重要组成部分。我国《食品安全法》《食品标识管理规定》和GB 7718—2011《预包装食品标签通则》等相关法律法规均要求规范食品标签，防止食品欺诈。但是我国并未建立具体针对水产品标签以及水产品俗名的规范使用的相关法律法规。一些商贩由于缺少基本的鱼类分类知识，滥用鱼类俗名，给市场带来巨大的混乱。

表3 GenBank和BOLD数据库中的鉴定结果

在本研究中，对于预包装冷冻鱼肉样品(13种)，只有南极犬牙鱼、巴沙鱼和鳕鱼同时标注有拉丁学名，分别为Dissostichusmawsoni、Pangasiushypophthalmus和Albatrossiapectoralis(表1),结果发现:仅南极犬牙鱼(S112)可以鉴定至物种水平，且鉴定结果与标签标注的物种一致；而巴沙鱼和鳕鱼的鉴定结果分别包含Pangasiushypophthalmus和Albatrossiapectoralis的多个来自不同属的物种，无法判定标签的正确与否;剩余的10种冷冻鱼肉样品均仅标注中文俗名。由于我国并未建立相关制度来规范水产品俗名的使用，其标签真实性无法评判。对于新鲜整鱼样品(29种)，均只标注中文俗名。只有15种可以准确鉴定到种水平，且除小黄鱼外，其他14种均与形态学鉴定结果一致。

鱼类俗名的滥用容易让消费者产生误解，如本研究中发现的用“鲈鱼”来标记Micropterussalmoides和用“海鲈鱼”及“金目鲈鱼”来标记Lateolabraxjaponicus。事实上，鲈鱼是指包含一大类鱼品种的统称，M.salmoides和L.japonicus都是我国市场上常见的鲈鱼品种。M.salmoides属于鲈形目、太阳鱼科、黑鲈属，原产于北美，20世纪80年代被引进我国。Fishbase登记的俗名为“大口黑鲈”和“似鲑赫罗鱼”。中文网站可以检索到M.salmoides的俗名包括“加州鲈鱼”。L.japonicus属于鲈形目鮨科花鲈属。Fishbase登记的俗名为“石斑”“过鱼”“花鲈”和“日本真鲈鱼”，但是中文网站可以检索到L.japonicus和Percafluviatilis(鲈形目河鲈科鲈属)的俗名均包括“海鲈鱼”。

鱼类俗名的滥用也给掺假制假者带来了可乘之机。如Carvalho等[14]指出，由于使用那些可以代表多个品种的俗名，巴西市场上17.3%的鱼肉制品发生品种掺假。而在我国台湾地区，Chang等[13]发现市场上因滥用鱼类俗名导致的鱼肉制品掺假率高达70%。在本研究中，虽然由于相关标准的缺失，大部分样品均无法判定是否掺假，但小黄鱼被鉴定为Larimichthyscrocea，与形态学鉴定不一致。

3 结论

首次利用DNA条形码技术对江苏市场上常见的鱼肉样品进行物种鉴定,结果表明:GenBank和BOLD数据库比对中所有样品均可以获得相似度大于98%的对应物种;种和属水平的最大鉴定成功率分别为40.48%(17/42)和50.00%(21/42)，表明DNA条形码技术对我国市场常见鱼肉样品的物种鉴定具有一定的可行性。

在采集的13种(36份)预包装冷冻鱼肉样品中，3种样品(S112、S113、S114)标注有物种拉丁学名，S113、S114皆鉴定出两个属，只有S112可以准确鉴定到种水平，且鉴定结果与标注的物种名一致。而29种(91份)新鲜鱼样品均仅标注中文俗名，有1种样品鉴定结果(S20～S26，小黄鱼)与形态学鉴定结果(Larimichthyspolyactis)不一致。

从本次研究结果看，江苏市场上存在鱼肉样品的物种掺假情况。水产品物种掺假不仅侵害了消费者的经济利益，而且误标的水产品会使消费者误食含有过敏原或者有毒的商品，这也会对消费者的健康安全造成威胁。因此，为防止由俗名滥用导致水产品掺假，建立我国水产品标签以及水产品俗名使用的相关法律法规迫在眉睫。