复合微生物菌剂在猪粪无害化处理中的应用

邵栓，朱群，李慧娟，常娟，王平，刘超齐，尹清强*

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002；2.玛纳斯县农业农村局，新疆 昌吉 832200；3.河南德邻生物制品有限公司，河南 新乡 453000；4.河南省郑州种畜场，河南 郑州 450011)

随着我国畜牧业向规模化和集约化的不断发展，大量未经处理直接排放的畜禽粪便给环境造成了严重污染[1-3]。因此，如何加快促进畜禽粪便无害化、减量化和资源化利用，已经成为畜牧业发展迫切需要解决的重要问题。由于畜禽粪便中氮、磷、钾及微量元素含量丰富，因此畜禽粪便堆肥化处理是解决畜禽粪便资源化利用的最有效途径[4-5]。传统的堆肥化处理由于堆肥周期长，不能有效控制堆肥过程中产生的臭气和病原菌，限制了其在规模化养殖场的推广应用[6]。高温好氧堆肥化处理，由于其对粪便中有机物分解速度快、最大程度地减少臭气排放及杀灭病原菌等优点，已成为当前畜禽粪便资源化利用中的一项重要研究内容[7]。高温好氧生物堆肥化处理是将各种堆肥原料按一定比例混合后，控制一定的堆肥条件，依靠微生物之间的相互作用,通过高温发酵分解有机物转变为肥料的技术[8]。

大量研究发现，在堆肥中加入功能性微生物菌剂，能相对延长堆肥高温持续时间，控制恶臭气体的转化，降低堆肥中的养分损失，改善堆肥微生物菌群组成。岳丹等[9]发现，有纤维素降解功能复合菌剂能降低堆肥中纤维素含量，提高猪粪堆肥期发酵温度，缩短堆肥周期。孙旭等[10]报道，复合菌剂能显著提高猪粪堆肥产品中速效氮、速效磷、速效钾含量。徐杰等[11]发现，有快速升温除臭功能的复合菌剂可以明显降低鸡粪堆肥过程中臭气浓度，降低堆肥中氮素损失，快速有效分解纤维素等有机物质。张生伟等[12]研究表明，与自然堆肥相比，在加入除臭功能复合菌剂的猪粪和鸡粪堆肥中，氮元素损失分别降低了25.84%和28.65%，同时都能促进硫元素向无机硫形式转化，减少恶臭气体排放。徐莹莹[13]发现，有木质纤维素降解能力的复合菌剂能促进堆肥有机质分解，减少堆肥中反硝化细菌数量。由于粪便堆肥发酵的菌种配伍、原料组合及发酵工艺等方面存在一些问题，本试验通过控制堆肥含水率，选择适宜除臭功能的微生物菌剂及发酵时间，研究其对堆肥温度、恶臭物质含量和微生物菌群的影响，为大规模堆肥生产提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

猪粪取自辉县市某养猪场，辅料玉米秸秆取自养猪场周围农场，机械粉碎至2～3 cm的小段。有除臭功能的复合微生物菌剂由河南农业大学饲料生物技术实验室制备，当各种菌浓度皆以1×109CFU/mL计算时，贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母和干酪乳杆菌在粪便发酵中的添加量分别为：0.05%、0.005%、0.001%和0.1%。堆肥原料的主要理化性质见表1。

表1 堆肥原料的主要理化性质(风干基础)

1.2 主要试剂配制

1.2.1 纳氏试剂

称取12 g氢氧化钠溶于60 mL水中，冷却待用；称取1.7 g二氯化汞溶于30 mL水中待用；称取3.5 g碘化钾于100 mL水中，在搅拌下缓慢加入二氯化汞溶液，直至形成红色沉淀不再溶解为止；把氢氧化钠溶液加入到二氯化汞和碘化钾的混合溶液中，再加入剩余的二氯化汞溶液，混合均匀后，放于暗处静置24 h，取上清液于棕色试剂瓶中，2～5 ℃保存。

1.2.2 铬酸钡悬浮液

称取19.44 g铬酸钾和24.44 g氯化钡，分别溶于1 L的去离子水中，在电炉上加热至沸腾。将两溶液混匀倒入一个3 L大烧杯中，待生成铬酸钡沉淀后倒出上清液，用去离子水洗涤5次沉淀，最后用去离子水定容至1 L，每次使用前需要摇动混匀。

1.3 堆肥试验设计

试验设5个处理组，每个处理3个重复，试验分组见表2。把收集的新鲜猪粪便称取80 kg于堆肥场空地上，用辅料玉米秸秆调节堆体含水率后，接入制备的复合微生物菌剂，混合均匀后用塑料薄膜密封发酵。试验期为28 d，第1周每2 d人工翻堆1次，后续每5 d人工翻堆1次，每个处理组在堆肥环节上保持一致。

表2 堆肥试验设计分组

1.4 样品采集

在各堆肥体堆肥结束时，翻堆混合均匀后，在堆体四角和中心点各取200 g左右样品，用四分法混合均匀后各取300 g左右装入自封袋中，10 g左右样品保存于4 ℃，用于测定微生物菌群和pH值指标，250 g左右样品保存于-20 ℃，用于测定全氮、铵态氮、硫酸盐、吲哚和水分指标。

1.5 指标测定

1.5.1 样品铵态氮的测定

参照HJ/T 535—2009《水质 氨氮的测定 纳氏试剂分光光度法》测定铵态氮。

标准曲线的建立：以硫酸铵为标准品绘制标准曲线，得到铵态氮浓度(μg/mL)与波长在420 nm下的吸光度值，建立回归方程Y=6.991 4X-0.038 8，R2=0.990 7。式中X为波长420 nm下的吸光度值，Y为铵态氮浓度(μg/mL)。

样品铵态氮测定：称取5 g样品加入25 mL 1 moL/L的NaOH溶液，180 r/min摇床振荡30 min，移至50 mL离心管中，3 000 r/min离心5 min，上清液即为样品测定液，吸取适当体积的样品测定液，测定吸光度值。

铵态氮计算：铵态氮(mg/g)=(A×B×N/1 000)/M，其中A为样品测定液由标准曲线求得铵态氮浓度(μg/mL)，B为反应液总体积(mL)，N为分取倍数，M为样品质量(g)。

1.5.2 样品硫酸盐的测定

参照HJ/T 342—2007《水质 硫酸盐的测定 铬酸钡分光光度法(试行)》测定硫酸盐。

标准曲线的制作：以无水硫酸钠为标准品绘制标准曲线，得到硫酸盐浓度与波长在420 nm下的吸光度值的回归方程Y=0.152 4X-0.000 7，R2=0.995 3。式中X为波长420 nm下的吸光度值，Y为硫酸盐浓度(mg/mL)。

样品硫酸盐测定：取5 g样品于150 mL三角瓶中，加20 mL去离子水，180 r/min摇床振荡4 h，静置2 h，加1滴10%醋酸锌溶液，用NaOH溶液调节pH值至9.0，转移至50 mL离心管中3 000 r/min离心5 min，上清即为测定液，吸取适当体积的测定液测定吸光度值。

硫酸盐计算：硫酸盐(mg/g)=(A×B×N)/M，其中A为样品测定液由标准曲线求得硫酸盐浓度(mg/mL)，B为反应液总体积(mL)，N为分取倍数，M为样品质量(g)。

1.5.3 样品吲哚的测定

参照文献[14]的方法。

标准曲线的建立：以吲哚为标准品绘制标准曲线，得出吲哚浓度(μg/mL)与波长在525 nm下的吸光度值的回归方程Y=0.001 7X+0.001 3，R2=0.992 4。式中Y为波长525 nm下的吸光度值，X为吲哚浓度(μg/mL)。

样品预处理：称取粪样5 g，加入0.1 mol/L NaOH 20 mL，振荡30 min，在100 ℃水浴条件下处理15 min，加入12.5 mL 0.1 mol/L NaOH，混合液转移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，静置30 min，上清液即为提取液。

样品吲哚的测定：取25 mL比色管，依次加入2 g/L二苯胺磺酸钠3 mL，1 mol/L HCl 6 mL。摇匀后加入10 g/L NaNO22.5 mL，待溶液紫色褪去后，4 ℃放置5 min。加入20 g/L氨基磺酸铵3 mL，待气泡逸出后，加入2 mL提取液，用蒸馏水定容至刻度线。于55 ℃条件下显色5 min，室温放置15 min，525 nm处测定吸光度值。粪便吲哚含量=(A×V1)/(W×V2)，其中A为标准曲线求得的吲哚浓度(μg/mL)，V1为提取液体积(mL)，W为样品质量(g)，V2为反应液体积(mL)。

1.5.4 其他指标的测定

温度的测定：堆肥期间每天12:30用数显式温度计分别测定每个堆体上、中和下层温度，取3个点的平均值，同时监测环境温度。

含水率的测定：采用105 ℃恒温干燥法。

全碳、全氮和pH的测定：按照NY525—2012《有机肥料》标准方法。

大肠杆菌和乳酸菌的测定：用稀释平板涂布法，大肠杆菌涂布于伊红美蓝培养基上(蛋白胨10 g、乳糖10 g、磷酸氢二钾2 g、琼脂15 g、伊红0.4 g、美蓝0.065 g、蒸馏水1 000 mL、pH值7.0～7.3)，乳酸菌涂布于乳酸菌培养基上(蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 10.0 g、酵母膏5.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温80 1.0 mL、乙酸钠5.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁 0.58 g、硫酸锰0.25 g、琼脂18.0 g、蒸馏水1 000 mL、pH值6.2～6.6)。37 ℃培养48 h，计算菌落数(CFU)，用自然对数(lg)表示。

1.6 数据统计与分析

试验数据采用Microsoft Excel 2003软件进行初步处理后，用SPSS 20.0软件进行ANOVA方差统计分析，结果用“平均值±标准差”表示，差异的显著性用P<0.05表示。

2 结果与分析

2.1 微生物菌剂对堆肥温度的影响

由图1可知，在整个堆肥期，A、B、C、D和E组堆肥最高温度分别为60、59.83、59.67、18.6和16.1 ℃，其中A、B和C组的堆体温度显著高于D组和E组(P<0.05)。A组50 ℃以上的堆肥温度下共保持4 d，B和C组共保持5 d。在堆肥8～12 d和20～21 d，B组发酵温度都高于A、C、D和E组(P<0.05)。堆肥结果显示，B组的堆肥发酵效果相对较好。

图1 堆肥过程中温度的变化(n=3)

2.2 微生物菌剂对堆肥微生物菌群的影响

由表3可知，堆肥中E组大肠杆菌数量最多，B组大肠杆菌数量最少，B组大肠杆菌数量分别比D和E组减少了60.26%和62.84%(P<0.05)。B组乳酸菌数量比E组提高了14.41%(P<0.05)。

表3 微生物除臭剂对堆肥微生物菌群的影响(n=3) lg(CFU/g)

2.3 微生物菌剂对堆肥有关恶臭物质的影响

由表4可知，A组和B组之间堆肥铵态氮的浓度差异不显著(P>0.05)，但A、B组均显著低于其他组(P<0.05)。B组堆肥铵态氮/全氮值最低，与A、C、D和E组相比，分别降低了19.60%(P>0.05)、31.99%(P<0.05)、42.81%(P<0.05)和58.37%(P<0.05)。B组堆肥吲哚浓度最低，与A、C、D和E组相比，分别降低了16.08%(P>0.05)、8.43%(P>0.05)、53.36%(P<0.05)和67.52%(P<0.05)。D组堆肥硫酸盐浓度最高，与A、B和C组相比，分别提高了49.89%(P<0.05)、31.07%(P<0.05)和40.42%(P<0.05)。堆肥结果显示，B组能最大程度地减少堆肥恶臭气体排放，提高堆肥养分质量。

表4 微生物除臭剂对堆肥恶臭组分的影响(风干基础，n=3)

3 讨论

3.1 微生物除臭菌剂对堆肥温度的影响

堆肥发酵是堆肥原料中的有机物在微生物作用下，快速分解释放大量的发酵热，使堆体温度逐步升高的过程，堆肥温度一直是评价堆肥进程的重要物理指标[15]。堆肥过程的温度一般需要经过升温、高温和降温3个阶段，其中高温阶段是堆肥最为关键的阶段[15]。堆体温度需保持在55 ℃达到3 d以上，或50 ℃达到5～7 d，是抑制堆体中病原微生物生长繁殖的重要条件[16]。通过在堆肥中添加功能性微生物菌剂可相对延长堆肥高温阶段持续时间，加快堆肥进程。李天枢[17]通过在由猪粪、牛粪和玉米秸秆组成的堆肥体中添加微生物菌剂，可使堆体在55 ℃以上维持5 d。王信等[18]在牛粪堆肥中添加微生物菌剂，仅用2 d时间温度就上升到了50 ℃，且能维持高温阶段9 d，12 d便可完成发酵。本研究在堆肥中加入由贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母和干酪乳杆菌复配而成的微生物菌剂，用以提高堆肥发酵热值，加快粪便发酵腐熟，取得了与前人一致结果。堆体水分含量是影响微生物生长代谢的重要因素，堆肥初始含水率在40%～70%才能保证堆肥的顺利进行[19]。本试验在控制堆肥含水率为40%～60%时，加入研制的复合微生物菌剂都可使堆肥在第4天达到最高温度，可能是因为加入的菌剂中厚壁菌门的芽孢杆菌耐热性有关，也有可能是加入的干酪乳酸杆菌对有机质的加速分解作用，不过温度的变化受外界因素的影响也较大。

3.2 微生物除臭菌剂对堆肥微生物菌群的影响

粪便大肠杆菌数量常被用来作为评价粪便无害化处理的重要指标。潘攀[20]把微生物菌剂加入堆肥体，在堆肥开始时，测得的大肠杆菌数量大约为3 ×103CFU/g，控制堆体的初始温度在45 ℃条件下，5 d后堆体中大肠杆菌的数量已经降到零，控制堆体初始温度在25 ℃和35 ℃条件下，堆肥进行8 d后堆料中己检测不出大肠杆菌。Turner[21]对堆肥中标记的大肠杆菌灭活所需的温度进行了研究，结果表明，超过55 ℃约2 h才能使大肠杆菌灭活。本试验发现，在堆肥结束时都能检测到大肠杆菌的存在，但在加入秸秆调节堆体初始水分含量为50%左右的B组大肠杆菌数量显著低于其他组。造成这种结果的原因可能是堆体维持的高温期时间较短，不能完全使堆体中的大肠杆菌灭活，由于B组高温持续时间长于其他组，使得检测到的大肠杆菌数量显著低于其他组，也说明了温度对大肠杆菌灭活的影响。

3.3 微生物除臭菌剂对堆肥恶臭组分的影响

畜禽粪便中含有大量的未被消化吸收的蛋白质，其在一系列微生物的作用下产生大量的含氮臭气，粪便堆肥过程中，有机氮的矿化、NH3的持续性挥发以及硝态氮的反硝作用是导致大量氮损失的重要原因，堆体铵态氮/全氮值的高低可以间接反应含氮化合物相互转化的关系，铵态氮/全氮比值越低，堆体沉积的氮就越多[22]。堆肥过程中氮的形态包括总氮、有机氮、铵态氮和硝态氮，氮的转化途径主要有氨化作用、硝化作用、反硝化作用和固定作用，大部分的挥发性氮素是在氮转化细菌对含氮有机物降解过程中产生的，主要有氨化细菌、硝化细菌、反硝化细菌和自生固氮细菌[13]。在堆肥中加入微生物菌剂成为减少肥料氮损失的重要方法，张生伟[23]将微生物除臭剂加入猪粪和鸡粪堆肥中，发现微生物除臭剂不仅有良好的除臭效果，而且减少了猪粪和鸡粪堆肥中25.84%和28.65%的氮元素损失。本研究发现，在猪粪堆肥中加入微生物菌剂，可相对减少总氮、铵态氮浓度、铵态氮/全氮比值，说明菌剂中优势微生物直接参与氮的转化，或通过与氮转化细菌的交互作用影响氮的代谢。

H2S和硫醇是含硫有害气体的主要成分，粪便中有机含硫化合物通过硫转化细菌的作用释放出含硫气体，H2S由于化学性质不稳定，可被硫氧化细菌氧化为硫酸盐，粪便中的硫酸盐和硫酸根在厌氧条件下通过硫酸盐还原细菌的活动是产生硫化氢的主要途径[24]。将微生物除臭剂加入猪粪和鸡粪堆肥，在堆肥结束时与自然堆肥相比，加入微生物除臭剂的堆肥硫酸盐含量显著高于自然堆肥，并减少了含硫气体的排放[23]。粪便中的蛋白质在一些腐败微生物的作用下被分解产生L-色氨酸，进一步分解产生吲哚，吲哚与粪便臭味的产生有密切关系[24]。本试验发现，在堆肥硫酸盐上，B组堆体硫酸盐含量高于A组和C组，说明B组在降低H2S排放方面要优于A组和C组；在吲哚的形成上，B组也显著低于A组和C组。造成上述结果的原因可能是由于B组堆体水分含量适中，有利于优势微生物的生长代谢，一方面优势微生物可以利用一部分恶臭物质，另一方面优势微生物可以抑制恶臭物质转化细菌的代谢活动，进而抑制有机质向恶臭物质转化，为畜禽粪污的无害化处理和资源化利用奠定了基础。