组蛋白去乙酰化酶对缺血性脑卒中病理过程调控的研究进展

陈学梅，黄志文，刘裕源，邓仪昊，何红云

(昆明理工大学医学院, 脑卒中病理研究实验室, 昆明 650500)

脑卒中俗称中风（cerebral stroke），又称为脑血管意外，是一种突发且进展迅速的脑缺血性或出血性疾病。中国面临着世界上最大的中风防治挑战，中风导致的死亡率位列第三，居恶性肿瘤和心脏病之后[1]，其中缺血性脑卒中占87%[2]，寻找有效治疗方法迫在眉睫。缺血性脑卒中发生后，导致细胞所需的氧气和葡萄糖供应不足，引起脑损伤，进而破坏细胞稳态，从而触发一系列病理生理过程，包括血脑屏障破坏、炎症、细胞凋亡和自噬等，导致不良的临床结果[3]。挽救半影区神经元是治疗缺血性脑卒中的关键，虽然在动物模型中已经鉴定出大量神经保护剂，但是，迄今为止，没有一种在临床试验中被证明是有效的[4]。

组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases,HDACs）是一个酶家族，对组蛋白和非组蛋白中的赖氨酸残基进行去乙酰化，这些蛋白质去乙酰化会对其功能、稳定性、亚细胞定位以及与其他蛋白质的相互作用产生显著影响，从而调控细胞的基因表达，调节与细胞存活和炎症等相关的多种信号通路[5]。由于HDACs在细胞质和细胞核中的分布不同，因此在脑缺血的相关机制中表现出不同的作用。HDACs和HDAC抑制剂（histone deacetylase inhibitors, HDACi）调节细胞存活的一系列过程，显著减少梗死面积，并在体内外发挥保护作用[6]。尽管现在已经批准了6种HDACi用于临床治疗，但它们都是很少或没有HDACs同工型选择性的泛抑制剂，具有明显的副作用。首先，多数特异性HDACi不能透过血脑屏障；其次，非特异性HDACi与一些副作用有关，如体重减轻和中风I/II期临床研究中的心律失常[4]。因为HDACi的使用尚未在缺血性卒中患者中提供令人满意的结果，所以探究组蛋白去乙酰化酶在脑卒中中的病理机制对于研发靶点药物具有重要的意义。

1 HDACs 的分类

HDACs根据序列、结构和功能同源性分为四个类别和18种亚型。第Ⅰ类、第Ⅱ类和第Ⅳ类被认为是“经典”的高密度脂蛋白，其活性受到曲古菌素A（trichostatin A , TSA）的抑制，并具有锌依赖的活性位点，第Ⅱ类又进一步划分为a型和b型。值得注意的是，Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅳ类HDACs的表达已在鼠脑和人脑中得到报道，显示出细胞和区域特异性模式[7]。第Ⅲ类是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+）依赖的蛋白家族——沉默信息调节因子2相关酶（sirtuins），不受TSA的影响。

2 HDACs 的结构与表达

第Ⅰ类HDACs在整体结构上类似，都含有一个催化结构域、底物结合位点和锌离子结合位点，除此催化结构域还包括2个金属离子结合位点，其中一个对去乙酰化酶反应有一定作用。第Ⅰ类HDACs一种核蛋白，在机体各组织器官中广泛表达，可在细胞核内与共同转录抑制子结合，使染色体组蛋白和非组蛋白去乙酰化，从而抑制转录[8]。

第Ⅱ类HDACs除了催化核心结构域外，Ⅱa类还拥有独特的、保守的N端延伸区域，其上包含多个结合位点，同时拥有一个位于N端的核定位信号区域和一个位于C端的核输出信号区域，因此它们可以在细胞核和细胞质之间穿梭。在催化活性部位靠近第一个锌离子结合位点的地方，第Ⅰ类HDACs和Ⅱb类HDACs拥有一个保守的酪氨酸残基，其侧链上的羟基能与氧化中间物相互作用并稳定这种过渡状态。第Ⅱ类HDACs的表达具有阶段特异性，特定的细胞信号可将其激活，Ⅱ类成员活化后可在细胞核和细胞质之间穿梭，在细胞核内通过类似于Ⅰ类成员的方式与共同转录抑制子结合，从而抑制转录[9]。

Sirtuins属于第三类HDACs，是酵母蛋白Sir2的同源物。Sirtuins的活性需要 NAD+，这使得这些酶对代谢和氧化还原变化敏感除具有一个催化核心结构域外，有的还具有N端和C端延伸区域，并且发现这些区域参与细胞定位、与其他蛋白相互作用、调节自身酶活性等[10]。Sirtuins使多种底物去乙酰化，如转录因子、细胞代谢酶和组蛋白，参与许多生物过程，包括新陈代谢、细胞生长、凋亡、自噬及衰老[11]。

HDAC11是第Ⅳ类HDACs中唯一的成员，也是目前已发现的HDACs中最短的蛋白，几乎只有核心的催化结构域，即只有去乙酰化酶活性。HDAC11可与运动神经元复合物的多个成员相结合，从而参与调节mRNA剪接[12]。

3 HDACs 在缺血性脑卒中的作用及调控机制

3.1 Ⅰ类HDACs

I类HDACs包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8。HDAC1、HDAC2和HDAC3主要存在于细胞核中，且HDAC1和HDAC2几乎相同，通常出现在抑制复合体中，HDAC3存在于不同的复合物中，而HDAC8没有复合物，存在于细胞核和细胞质中，并且与膜相关。

3.1.1 HDAC1

HDAC1作为重要的转录调节因子，参与许多生物过程。HDAC1主要在神经元中表达，但也在胶质细胞中表达。在神经退行性病变转基因模型中，HDAC1提供有效的保护，防止培养的神经元和体内缺血模型中的DNA损伤和神经毒性。短暂大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO）导致皮质中mRNA水平逐渐下降，而HDAC1可有效保护DNA免受损伤[13]。此外，HDAC1过表达还可以通过诱导小胶质细胞极化从而减小梗死体积[14]。有研究显示， HDAC1的神经毒性取决于其从细胞核输出到细胞质，导致轴突运输中断和线粒体功能障碍。细胞质HDAC1对轴突运输的毒性作用是由于它具有能够与运动蛋白和α-微管蛋白结合，破坏它们与货运蛋白形成复合物的能力[15]。

3.1.2 HDAC2

在缺血半影区，HDAC2局限于神经元细胞核中，广泛存在于星形胶质细胞的核、细胞体和突起中。tMCAO导致皮质HDAC水平逐渐降低或HDAC水平无变化[16]。而在氧-糖剥夺（oxygen-glucose deprivation, OGD）损伤后，在初级皮质神经元中发现HDAC2基因的强诱导[17]。野生型（wild type, WT）和HDAC2敲除小鼠能通过提高细胞存活率和减少神经炎症来促进运动功能的恢复，而过表达HDAC2则加重了中风诱发的功能障碍[5,18]。

3.1.3 HDAC3

来自细胞培养和体内模型的大量证据表明，HDAC3促进神经退行性病变，此外，它被认为是HDACi产生神经保护作用的主要靶点[19]。在缺血、缺氧的皮质神经元中发现HDAC3显著表达，并且siRNA特异性敲除HDAC3能增加皮质神经元的存活率，此外，siRNA敲除HDAC3模拟缺血再适应的有益效果，其中钙蛋白酶介导的HDAC3的C端断裂在体内外负责缺血预适应[18,20]。HDAC3选择性抑制剂RGFP966可以从细胞核中清除HDAC3，并在体内和培养的神经元中保护神经元免受损失[21]。因此，无论是药物抑制还是敲除HDAC3，对缺血性脑卒中都具有保护作用。

3.1.4 HDAC8

HDAC8主要存在于神经元的细胞质中。在tMCAO后皮质HDAC8基因水平降低或无变化，而在光血栓性卒中（photothrombotic stroke, PTS）7d、14d后脑组织神经元和星形胶质细胞中HDAC8活性升高[18]。相应地，在初级皮质神经元中，OGD导致HDAC8基因的瞬时诱导[17]。在氧化损伤后，HDAC8敲除的小鼠神经元中细胞死亡增加[22]。

3.2 Ⅱ类HDACs

Ⅱ类HDACs包括HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9和HDAC10。根据蛋白质结构，它们可以分为两个亚类，Ⅱa类（HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9）和Ⅱb类（HDAC6、HDAC10）。

3.2.1 Ⅱa类HDACs

Ⅱa类HDACs的两种亚型HDAC4和HDAC5在结构上相似，在大脑中大量表达，主要在细胞质中表达。HDAC7在内皮细胞和胸腺细胞中富集。HDAC9在肌肉、心脏和大脑中高度富集化。

HDAC4：在缺血性卒中时观察到调节异常的HDAC4，影响神经元死亡、血管生成和神经发生，在缺血性卒中和卒中后恢复的机制中发挥关键作用。例如，在缺血性中风模型和OGD处理的神经元中，HDAC4减少，而HDAC4的低表达可增加缺血性脑卒中的梗死体积，减少OGD处理的神经元的细胞活力，且低水平的HDAC4与细胞增殖和血管生成以及血脑屏障完整性丧失相关[23]。另一方面，中风诱导神经元中HDAC4的核穿梭加重了神经元死亡。相比之下，核HDAC4的增加与神经元重塑密切相关，但与神经元细胞死亡无关[24]，表明核HDAC4在促进缺血性损伤后神经元恢复中的中作用。此外，缺血增加了内皮细胞中HDAC4的磷酸化，这是通过体内和体外的缺氧诱导因子——血管内皮生长因子信号促进卒中后血管生成[25]。综上可以看出，HDAC4不同的细胞定位可解释其在不同条件下的神经保护作用或神经毒性作用。

HDAC5：在体外培养的神经元中，HDAC5均匀分布在胞核和胞质中[26]。在中枢神经系统中，HDAC5参与神经元分化。研究表明，HDAC5可抑制心肌相关转录因子-A的抗凋亡作用，该因子在缺血和再灌注时调节皮质神经元的凋亡[27]。有趣的是，HDAC4和HDAC5在正常和缺血皮层的神经元树突中表达，表明在缺血损伤后，HDAC4和HDAC5促进树突生长[24]。

HDAC7：HDAC7具有神经保护作用，并非依靠其去乙酰化酶活性，而是通过抑制c-jun，而c-jun是一种在神经元死亡中起重要作用的转录因子[28]。tMCAO后和OGD治疗的初级皮质神经元中HDAC7水平没有显著改变[17]。在后肢缺血模型中，HDAC7衍生的7-氨基酸肽(HDAC7的剪接形式)可以增加血管干细胞的迁移和分化，以增强血管生成和改善血管损伤[29]。在其它研究中发现，HDAC7可能与星形胶质细胞功能和增生的调节有关，星形胶质细胞增生是脑损伤的一个适应性过程[30]。

HDAC9：HDAC9在神经元中发挥多种生理功能，例如，调节基因表达和树突的生长及发育[31]。另一方面，已知HDAC9加重了中风后脑血管内皮细胞损伤[32]。tMCAO后，皮质HDAC9水平降低或升高，而在OGD处理的初级皮质神经元中未发现显著变化[33]。此外，与WT小鼠相比，HDAC9 敲除小鼠通过抑制炎症反应，在tMCAO后产生了较小的梗死体积和神经功能的改善[34,35]。

3.2.2 Ⅱb类HDACs

HDAC6、HDAC10是Ⅱb类HDAC的成员，结构相似，但亚细胞定位和去乙酰靶标不同。这表明，HDAC6和HDAC10可能具有不同的功能。但是两者都被反复与细胞应激反应、蛋白质降解和自噬联系在一起。

HDAC6：HDAC6是一种主要的细胞质酶，其细胞定位受核输入和输出信号的调节[36]。脑卒中后半影区生长相关蛋白-43（growth associated protein-43,GAP-43）的高表达是轴突生成的早期信号，选择性抑制HDAC6可增加GAP-43的表达，GAP-43在中风后14天内保持高表达，可能有助于神经功能从PTS诱导的缺陷中恢复[37]。此外，有研究表明tubastatin A（HDAC抑制剂）诱导的HDAC6活性下降恢复了细胞的α-微管蛋白乙酰化在脑卒中后早期恢复和减少神经细胞凋亡，可以保护胶质细胞免受缺血性损伤，并促进中风后脑组织的恢复[38]。

HDAC10：HDAC10对溶酶体的稳态很重要，但其去乙酰化目标和功能特征不佳[39]。研究表明，HDAC10促进自噬[40][36]。最近的研究表明[41]，HDAC10在作用后使热休克同源蛋白70kDa(heat shock cognate 70 kDa protein, HSC70)去乙酰化，HSC70在伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA)中起重要作用，结合CMA底物并将其转运到溶酶体。HDAC10敲除激活了CMA并加速了CMA底物的降解速率。因此，抑制HDAC10的表达可能对治疗神经退行性疾病有效，其中CMA下调是主要的原因。

3.3 Ⅲ类HDACs

Sirtuins在哺乳动物中有7种亚型，SIRT1-7。SIRT1和SIRT6主要位于细胞核中，SIRT2位于细胞质中，SIRT3-5是线粒体蛋白，SIRT7位于核仁中。Sirtuins功能取决于细胞类型、细胞内定位、Sirtuins亚型对不同底物的特异性和酶翻译后修饰的性质。

SIRT1在许多关于缺血性卒中的研究中显示出神经保护作用。在缺血性脑损伤方面，SIRT1活性降低可能会加重小鼠永久性的缺血性脑损伤。OGD后，SIRT1通过AMPK-PGC1途径抑制SIRT3表达，导致线粒体活性氧生成，进而导致血脑屏障通透性降低和细胞凋亡。血脑屏障破坏和随之而来的脑水肿是导致缺血性卒中后神经功能障碍和死亡的关键致病因素。此外，SIRT1通过诱导核因子κB下调和p53诱导的凋亡通路以及炎症来保护脑缺血损伤[42]。许多结果表明SIRT2在神经退行性疾病和其他病理状况中起着有害的作用，但其在脑缺血的结果不太清楚[43]。SIRT3是唯一具有显著去乙酰酶活性的线粒体蛋白，SIRT3可以调节代谢和退行性疾病，有助于防止肺动脉高压以及缺氧和缺血状况[44]。SIRT3可以通过调节线粒体神经酰胺的合成来减少PTS小鼠模型的脑组织损伤。SIRT4在发育早期的大脑中高表达，特别是星形胶质细胞中，SIRT4可以诱导线粒体通透性转换孔开放，从而引发线粒体介导的凋亡[45]。SIRT5 通过降解紧密连接蛋白occludin 来增加血脑屏障通透性，从而介导缺血/再灌注诱导的脑损伤。SIRT5基因敲除和WT的小鼠在缺血/再灌注后，均减少了脑梗死面积，改善了神经功能，减弱了卒中后的全身炎症[46]。SIRT1和SIRT6被认为是各种衰老相关疾病的潜在靶点，即核Sirtuins的激活可以作为代谢和神经退行性疾病的治疗方法，但有研究表明SIRT1、SIRT2 和SIRT6不参与小鼠PTS后半影区细胞的凋亡[11]。在正常细胞内稳态中，SIRT7是rRNA和蛋白质合成的重要调节器，可以调节细胞凋亡和应激反应。但是尚不清楚SIRT7在缺血性脑卒中中的作用。在Lv J等[47]的研究中，他们发现在OGD复氧治疗后，神经元中SIRT7的表达显著增加，SIRT7的敲除加重了OGD诱导的损伤，增加了p53总蛋白和乙酰化蛋白的水平，此外，还增加了p53对凋亡的转录活性，激活了p53介导的促凋亡信号通路。总之，结果表明SIRT7参与保护神经元免受OGD复氧诱导的损伤，可能是通过调节p53介导的促凋亡信号通路。

3.4 Ⅳ类HDACs

HDAC11在脑、心脏、肌肉、肾脏和睾丸中表达丰富，但对其功能知之甚少。体内tMCAO和体外OGD原代皮层神经元培养后，未发现HDAC11水平的显著变化[17]。相反，在tMCAO后，HDAC11 mRNA短暂增加，而蛋白质显著降低[21]。

4 总结

脑卒中发病率和致残率高，其中缺血性脑卒中占脑卒中总发病率的一半以上，研究缺血性脑卒中的病理过程及寻找治疗的靶点是挽救卒中病人治疗的关键。基于HDACs在缺血性脑卒中病理过程中发挥的作用，靶向HDACs治疗可能是一种有效的治疗方式。但由于其发挥作用的机制复杂多变，因此，距离临床上使用还有很大的挑战。其次，HDACs在缺血性脑卒中的作用仍有许多未解之谜，因此探讨HDACs在缺血性脑卒中病理机制中的调控机制，明确参与卒中的具体亚型，将是研发特异抑制剂治疗卒中的有效途径。