三七总皂苷对新生血管性视网膜病变的干预效应及机制研究＊

金茹娜，郭 红，徐 静，2，杜霄烨，2，张 腾，2，陈 瑜，2＊＊

（1. 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院 上海 200437；2. 上海市中医药研究院中西医结合临床研究所上海 200437；3. 上海中医药大学岳阳临床医学院 上海 201210）

新生血管性视网膜疾病是多种视网膜疾病致盲的主要原因之一，包括早产儿视网膜病变、增殖性糖尿病视网膜病变等，可以导致严重的视力下降甚至致盲[1,2]。流行病学调查结果显示，在2010年全球约有18.47 万早产婴儿发生早产儿视网膜病变，其中有2 万人失明或严重视力受损，还有1.23 万人中度视力障碍[3]；在国际糖尿病联盟（IDF）最新发布的全球第八版糖尿病地图中显示，2017年全球糖尿病成人患者已达4.25亿[4]，而一项关于2015年-2018年全球糖尿病性视网膜病变的调查结果显示，患病率为27%[5]。

视网膜新生血管（Retinal neovascularization，RNV）的形成是新生血管性视网膜病变重要的病理环节之一，也是致盲的主要原因。在视网膜缺血缺氧等病理情况下，RNV 形成将起到不良作用[6-7]，如血管通透性增加，导致组织水肿，或引起大量出血，严重影响视功能。关于RNV 的治疗，目前视网膜激光光凝和玻璃体腔注射抗VEGF 药物在临床的应用最为广泛，但是存在视野缺损、视网膜色素上皮撕裂、加速视网膜下纤维化增生、诱导黄斑萎缩、以及光感受器细胞（主要是视锥细胞）的变性等缺陷[8-10]，这不得不让我们思考治疗新生血管性视网膜病变的其他干预方法。

三七是我国传统的名贵药材，为五加科人参属植物三七（Panax notoginseng(Burkill) F.H. Chen）的干燥根和根茎，具有散瘀止血、消肿定痛的功效[17]，是传统的活血化瘀药物，在治疗眼底出血性疾病时，具有止血而不留瘀的特点。含有三七或其组分的复方血栓通胶囊、血塞通注射液，以及三七粉等均在眼科临床广泛使用，对于新生血管性视网膜疾病有较好的疗效，但其作用机制尚缺乏系统的实验研究。现代药理研究表明，三七总皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）是三七公认的主要有效成分之一，课题组成员在前期关于PNS 及其组分的药理学研究中发现，PNS 具有抗氧化[11]、抗炎、抗动脉粥样硬化[12]、双向调节肿瘤及心肌缺血血管新生[13]、改善心肌缺血和抑制肿瘤生长的双重作用[14]，以及在光损伤视网膜小鼠模型中，PNS可显著抑制光损伤小鼠视网膜的氧化应激及炎症反应，对光损伤小鼠视网膜光感受器细胞具有保护作用[15]。因此本研究对PNS干预新生血管性视网膜病变的效应和机制进行研究，以期为三七应用于相关眼底病的治疗提供部分科学的实验和理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF 级C57BL/6J 新生幼鼠购自于上海市斯莱克实验动物有限公司，记录新生幼鼠天龄，以出生当天记为P0，至P21期间小鼠与母鼠同笼。

1.2 实验药品及试剂

三七总皂苷（纯度≥98%）：上海泛亚生物医药集团；复方托吡卡胺滴眼液（美多丽）：参天制药株式会社；羟丙基甲基纤维素：Sigma-Aldrich；荧光素钠（F6377-100G）：Sigma-Aldrich；甲醛：上海国药集团化学试剂有限公司；OCT 冰冻切片包埋剂：Sakura；GFAP抗体：DAKO；PBS：Gibco。

1.3 实验设备

动物富氧（缺氧）箱（XBS-02B，艾普仪器），小动物视网膜成像显微镜（Micron IV，Phoenix Research Laboratories，Lnc），全视网膜眼电图Ganzfeld ERG 系统（Micron IV，Phoenix Research Laboratories，Lnc），冰冻切片机（CM3050S，LEICA），微量紫外分广告光度计（BIOSPEC-NANO (230 V)，SNIMADZU BIOTECH），PCR 定量测试仪（22331 Hamburg，Eppendorf），实时荧光定量分析仪（Light Cycler 480 Ⅱ，Roche Diagnostics）。

2 实验方法

2.1 分组与给药

2.1.1 分组方法

将P7 的小鼠根据体质量随机分为正常对照组（NC 组），氧诱导视网膜病变模型组（OIR 组），三七总皂苷治疗组（PNS组）。

2.1.2 给药方法

P12小鼠从回到正常空气时开始给药。在预初实验中，根据血塞通注射液的临床使用剂量换算小鼠给药剂量，PNS 组设计了50 mg·kg-1、100 mg·kg-1和150 mg·kg-13 个浓度梯度给药，视网膜血管渗漏结果提示50 mg·kg-1和150 mg·kg-1给药剂量无效，故本研究PNS组按照PNS 100 mg·kg-1的剂量，使用0.9%氯化钠注射液溶解，腹腔注射给药，注射量为第1周50µL/只，第2周60µL/只，第3周70µL/只；NC组和OIR组给予等量0.9%氯化钠注射液腹腔注射。根据实验需要，给药1周或3周不等。

2.2 氧诱导视网膜病变小鼠模型造模方法

将P7 的OIR 组和PNS 组小鼠同母鼠放置于动物富氧箱，接入医用氧气，控制含氧体积分数为75% ±2%，温度维持在23℃，共放置5天，其中更换母鼠1次，至P12 时，将小鼠和母鼠一同放回正常空气的室内饲养。

2.3 指标检测

2.3.1 血管渗漏的图像采集和渗漏面积的测量

将P19 小鼠麻醉和散瞳后，0.25%羟丙基甲基纤维素溶液点左眼保护角膜，腹腔注射荧光素钠（按5µL·g-1，总量不超过50µL）并开始计时。小动物视网膜成像显微镜进行视网膜血管拍照，采集时确保每只小鼠视乳头位于图像中心，视网膜浅层大血管成像清晰，于10 min 时采集并保存图像。采用Image J 软件，沿荧光素钠渗漏图像边缘绘制不规则图形，并自动生成图形面积，单位换算为mm2，可用于统计分析。

2.3.2 视网膜动脉迂曲的图像采集和视网膜动脉迂曲指数的测量

将P33 小鼠麻醉和散瞳后，0.25%羟丙基甲基纤维素溶液点左眼保护角膜，腹腔注射荧光素钠（按5µL/g，总量不超过50µL）。小动物视网膜成像显微镜进行视网膜血管拍照，采集时确保每只小鼠视网膜浅层大血管成像清晰，保留宽度最大的静脉周围伴行的动脉长度≥300 µm。参考相关文献报道[16]，采用MATLAB 软 件，打 开QUANGT BV 程 序（从www.QuantBV.com 下载），运行“Vessel_Tortuosity.m”文件，选取需要测量的视网膜血管照片中与宽度最大的静脉伴行的一根动脉，从视乳头边缘开始沿动脉走行画点。根据该程序的说明书，NC 组采集长度大约（175±25）μm，OIR 组和PNS 组采集长度大约为（275±25）µm，视网膜动脉迂曲度指数（Retinal artery tortuosityindex，RAT index）为血管实际长度（即沿血管走行画点的总长度）与线性距离（及第一个点与最后一个点的直线距离）的比值，该比值可用于统计分析。

2.3.3 视网膜电图的波形采集和振幅测量

P30 小鼠放置于暗室内3 天，P33 小鼠在暗室内进行ERG 的波形采集，将小鼠麻醉和散瞳后，0.25%羟丙基甲基纤维素溶液点左眼保护角膜，将小鼠放置于有加热垫的操作台上，在小鼠双眼之间的中央处皮肤表皮下插入红色金属丝电极，黑色接地电极插于小鼠尾部表皮下，采用全视网膜眼电图Ganzfeld ERG 系统进行ERG 图像采集（表1），利用该系统内软件自动分析，得到每个刺激强度a 波和b 波的平均振幅用于统计分析。

表1 视网膜电图刺激强度与间隔时间

2.3.4 小鼠眼杯制作和免疫荧光染色

P46 和P66 小鼠脱颈处死，取左眼眼球（保留视神经），10xPBS 溶液清洗后放于4%甲醛溶液固定30 min，在显微镜下用眼科显微剪沿角膜缘一周剪除角膜，轻轻取出晶状体后所保留的部分即为眼杯。梯度蔗糖脱水，OCT 包埋眼杯（注意视神经保持在水平方向），液氮速冻，转入-80℃冰箱保存。冰冻组织切片约10µm，用免疫荧光染色法观察GFAP 的表达情况。采用正置荧光显微镜，从视乳头开始拍照保存，每侧拍取3张。

2.3.5 小鼠视网膜取材和相关细胞因子的mRNA检测

P13和P15小鼠脱颈处死，取左眼眼球，0.9%氯化钠注射液清洗眼球表面残留血液，显微镜下用显微剪将角膜剪开，宽度约为晶状体直径大小，取出晶状体，轻轻挤出视网膜，将视网膜放入装有500µL Trizol 的RNase free EP 管中，存放于-80℃冰箱。采用Real Time-PCR 检测VEGFA（血管内皮生长因子A）、VEcadherin（血管内皮细胞钙粘蛋白）、TNF-α（肿瘤坏死因子-α）、IL-1β（白介素-1β）的mRNA表达（表2）。

表2 引物序列表

2.4 数据分析方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，实验数据以“均数±标准误”表示，使用独立样本T 检验比较两组间差异，以P＜0.05作为差异有统计学意义的标准。

3 实验结果

3.1 三七总皂苷对氧诱导视网膜病变小鼠体质量的影响

有研究发现，OIR 小鼠过低的体质量与视网膜病变严重程度密切相关[19]，因此本课题选取P7、P12、P19、P26和P33五个时间点，测量3组小鼠体质量变化情况，以此来评价PNS 干预效应是否与小鼠体质量有关（图1）。NC 组、OIR 组和PNS 组的小鼠在生长发育中不同天龄的体质量均无统计学差异（P＞0.05）。结果显示，PNS 对于OIR 小鼠生长发育中的体质量变化无明显影响，提示本课题在评价PNS 的干预效应时可排除小鼠体质量的影响。

图1 3组小鼠不同天龄体质量的比较

3.2 三七总皂苷对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜血管渗漏的影响

正常小鼠在出生后视网膜血管发生仍在持续，而OIR 小鼠视网膜血管因相对缺氧，促使大量新生血管生成，但此时的新生血管是否与正常血管功能相同？因此，本实验在早期缺氧时，即P12 开始给药1 周，于P19 活体进行视网膜血管造影（图2A），P19 小鼠腹腔注射荧光素钠后到10 min 时，NC 组小鼠视网膜血管几乎无荧光素钠渗漏，OIR 组小鼠视网膜血管荧光素钠渗漏明显，PNS 组P19 小鼠经过给药1 周，视网膜血管虽出现荧光素渗漏，但渗漏面积明显小于OIR 组。将3 组小鼠视网膜渗漏荧光素钠的面积定量分析（图2B），OIR 组渗漏面积与NC 组相比有统计学差异（P＜0.05）；PNS 组渗漏面积与OIR 组相比有统计学差异（P＜0.05）。本实验结果显示，PNS组小鼠视网膜血管荧光素渗漏面积显著小于OIR 组，提示PNS 具有显著抑制P19 OIR小鼠视网膜血管渗漏的效应。

图2 P19三组小鼠视网膜血管渗漏的比较

3.3 三七总皂苷对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜动脉迂曲的影响

图3 P33三组小鼠视网膜动脉迂曲程度的比较

课题组在进行P19小鼠的视网膜血管造影实验中发现，除血管渗漏外，还可见OIR 小鼠视网膜动脉迂曲明显，该病理改变是否持续到血管修复完成，而PNS是否对其具有干预效应？因此，在给药3 周后，将P33小鼠再次进行活体视网膜血管造影图像采集（图3A），P33 小鼠腹腔注射荧光素钠后，NC 组小鼠视网膜动脉走形笔直，OIR 组小鼠视网膜动脉迂曲明显，PNS 组小鼠经过给药3 周，视网膜动脉虽有迂曲，但明显优于OIR 组。在所采集的视网膜血管造影图像中，选取需要测量的视网膜血管照片中与宽度最大的静脉伴行的一根动脉，从视乳头边缘开始沿动脉走行画点，应用数学软件MATLAB 运行QUANGT BV 程序，获得RAT index 用于统计分析（图3B），OIR 组RAT index 为与NC 组相比有统计学差异（P＜0.05）；PNS 组与OIR组相比有统计学差异（P＜0.05）。实验结果显示，PNS组小鼠视网膜动脉迂曲指数显著小于OIR 组，提示PNS具有显著改善视网膜动脉迂曲度的效应。

3.4 三七总皂苷对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜功能的影响

视网膜电图的波形可以反映出视网膜神经元传导功能，所测得的波形主要由负向的a 波和正向的b波组成，其中a 波所反映的是视网膜一级神经元即光感受器细胞的功能，而b 波所反应的是视网膜二级神经元即双极细胞的功能。3 组小鼠所采集到的波形图显示（图4A），P33 时3 组小鼠的a 波随着刺激强度的增大，其振幅也随之增大，3 组之间波形相近，提示氧诱导视网膜病变小鼠的一级神经元功能未受到损伤。NC 组小鼠b 波随着刺激强度的增大，其振幅随之增大，而OIR 组的b 波在各刺激强度下，振幅明显小于NC 组，且随着刺激强度的增大，b 波振幅增加不明显；PNS 组小鼠b 波与NC 组相近，即随着刺激强度增大，其振幅也随之增大，且在不同刺激强度下，b波振幅均明显大于OIR组。

图4 P33三组小鼠视网膜电图的比较

将3 组小鼠ERG 中的a 波在不同刺激强度下的振幅分别予以定量，OIR 组a 波振幅与NC 组相比无统计学差异（P＞0.05）；PNS 组a 波振幅与OIR 组相比亦无统计学差异（P＞0.05）（图4B）。实验结果提示氧诱导视网膜病变小鼠一级神经元未受到损伤。

将3组小鼠ERG 中的b波在不同刺激强度下的振幅分别予以定量。在刺激强度为0.4 log cd·s·m-2和1.6 log cd·s·m-2时，OIR 组b 波振幅与NC 组相比有统计学差异（P＜0.05）；PNS 组b 波振幅与OIR 组相比有统计学差异（P＜0.05）（图4C）。实验结果提示，氧诱导视网膜病变小鼠二级神经元受到损伤，而PNS 具有显著改善视网膜二级神经元功能的效应。

图5 P46和P66三组小鼠视网膜GFAP表达的比较

3.5 三七总皂苷对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜反应性胶质增生的影响

P46 和P66 小鼠OIR 组的视网膜Müller 细胞胞体粗大，并可达内核层（Inner nuclear layer，INL）和外核层（Outer nuclear layer，ONL），GFAP 免疫阳性明显增强；PNS 组和NC 组相近，未见Müller 细胞GFAP 免疫阳性（图5）。实验结果提示，PNS 具有显著抑制视网膜Müller细胞反应性胶质增生的效应。

3.6 三七总皂苷干预氧诱导视网膜病变的机制研究

VEGF 家族在血管通透性及血管新生中有着重要的调节作用，其中，VEGFA 是最重要的血管内皮生长因子，特异性表达在血管内皮上；而血管内皮细胞屏障功能的发挥主要依赖内皮细胞间的连接，其中VEcadherin 是血管内皮细胞所特有的，专一表达在血管内皮细胞表面，主要连接内皮与内皮细胞，在调节血管通透性中起重要作用。此外，炎症因子在血管通透性和血管新生中也起到关键的作用。P13 和P15 OIR组小鼠视网膜VEGFA mRNA 表达水平均显著高于NC组（P＜0.05），而PNS 组与OIR 组相比无明显差异（P＞0.05），提示PNS 对VEGFA 的mRNA 水平无明显干预作用；P13 和P15 OIR 组小鼠视网膜VE-cadherin mRNA 表达水平均显著低于NC 组（P＜0.05），而P15 PNS 组显著高于OIR 组（P＜0.05），提示PNS 可显著上调OIR 小鼠视网膜VE-cadherin 的mRNA 水平，可能与其抑制血管渗漏有关；P13 和P15 的NC 组小鼠视网膜TNF-α在real-time PCR 检测中无明显扩增，而PNS组小鼠视网膜TNF-αmRNA 表达水平均显著低于OIR 组（P＜0.05），提示PNS 可以显著下调OIR 小鼠视网膜TNF-α的mRNA 水平，是PNS 抑制视网新生血管相关炎症反应的效应，同时可能是PNS 降低血管渗透性的分子机制之一，亦可能部分参与PNS 上调VEcadherin 的效应；P13 和P15 OIR 组小鼠视网膜IL-1βmRNA 水平显著高于NC 组（P＜0.05），但PNS 组与OIR 组相比无统计学差异（P＞0.05），提示此时的炎症反应激活了IL-1β参与，但PNS并未通过干预IL-1β发挥抗炎作用（图6）。

4 讨论

新生血管性视网膜病变在中医学中无对应的病名，但根据其临床表现，可归属“视瞻昏渺”“暴盲”“消渴目病”等范畴，是眼科血证，主要表现为眼内视衣络损瘀阻或血溢脉外，多为血瘀或瘀血之症，因此历代医家多以活血化瘀为总的治疗原则。三七具有止血而不留瘀的特点，是治疗眼底出血性疾病的常用中药之一。三七总皂苷是三七的主要成分之一，其相关制剂常用于眼底出血性疾病的治疗，深入探讨其干预视网膜新生血管的作用机制有助于三七及三七皂苷制剂在眼科临床科学合理的应用。

神经血管单元概念在2001年美国国家神经疾病和中风研究所的中风进展评论组会议上被正式提出[21]，近年来在视网膜新生血管性疾病的研究中受到越来越多的关注。缺血、缺氧、高糖等病理情况可引起视网膜血管的渗漏或者出血，破坏神经血管单元稳态，从而影响视网膜正常的细胞信号传导，同时在相关细胞因子的作用下，促进新生血管生成，或可导致突触变性和神经元凋亡以及视功能受损[21]。因此，基于视网膜血管、神经元、胶质细胞等神经血管单元的整体研究，有助于阐释中药多靶点的治疗效应。本研究结果提示PNS 可显著抑制OIR 小鼠视网膜血管渗漏、降低视网膜动脉迂曲度、保护视网膜神经元功能、抑制Müller细胞反应性胶质增生，从血管渗漏、动脉形态、视网膜神经元功能和神经胶质细胞的反应性改变等方面进一步阐释了PNS 对视网膜神经血管单元的保护效应，为PNS 多靶点干预视网膜新生血管的优势效应提供了新的实验依据。

图6 P13和P15三组小鼠视网膜VEGFA、VE-cadherin、TNF-α、IL-1βmRNA表达比较

在OIR 小鼠模型中，缺氧诱发的视网膜血管新生的病理学特征之一是血管渗漏，是后续整个病理过程的始动因素，因此结合这一部分的实验结果，我们进一步对参与这一早期病理改变的相关基因的mRNA表达水平进行研究。VE-cadherin 是经典钙粘蛋白超家族的成员，是内皮细胞细胞间粘附连接的重要组分，在调节血管通透性中发挥重要作用[22]。有研究表明，缺血缺氧可激活相关的细胞因子，包括VEGF，使VE-cadherin 磷酸化，导致血管的通透性增加，破坏血视网膜内屏障，引起血管渗漏[23,24]。本课题研究结果表明，P13 和P15 的OIR 小鼠视网膜中VE-cadherin 的mRNA 水平显著下调，提示OIR 小鼠视网膜血管渗漏可 能 与VE-cadherin 有 关，而PNS 组 在P15 时，VEcadherin 的mRNA 水平显著上调，提示PNS 显著抑制血管渗漏的效应可能与上调该基因的表达，使得内皮细胞粘附连接增强有关。

此外，炎症因子TNF-α可诱导VE-cadherin 及其结合配偶体β-catenin，plakoglobin 和p120 的酪氨酸磷酸化[25]；TNF-α还可引起VE-cadherin 转录水平下调[26]，且这一机制与其诱导血管高渗透性的效应相关。本研究结果表明，TNF-α在正常视网膜中无明显扩增，仅表达在OIR及PNS小鼠视网膜中，而PNS组TNFα表达水平显著低于OIR组，提示PNS具有抑制视网新生血管相关炎症反应的效应，同时亦可能是其上调VE-cadherin、减轻血管高渗透性的分子机制之一。

值得注意的是，VEGF 家族是调控血管生成及血管通透性的重要分子，其中VEGFA 是最重要的血管内皮生长因子。本研究结果表明P13 和P15 OIR 组小鼠视网膜VEGFA mRNA 表达水平均显著高于NC 组，而PNS 组与OIR 组相比无明显差异。此外，在OIR 小鼠视网膜中，炎症因子IL-1βmRNA 水平显著上调，但PNS 组与OIR 组相比无明显差异，表明IL-1β参与视网膜炎症反应，但PNS 并未通过干预IL-1β发挥抗炎作用。上述研究进一步提示PNS 在调控血管渗透性及视网膜炎症等重要病理过程中对VE-cadherin 及TNF-α表达的选择性作用，深入的分子机制有待进一步的研究。

综上所述，本研究基于缺氧诱导的视网膜病变，首次揭示了PNS 干预视网膜新生血管相关神经血管单元异常的效应，提示了其缓解视网膜新生血管渗漏及相关视网膜炎症的可能分子机制，为三七皂苷及相关制剂临床应用于相关视网膜微血管病变的防治提供了新的实验依据。