酱香型白酒大曲中功能微生物菌群及其酶系研究进展

（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳 550025）

中国白酒是世界上最古老的蒸馏酒之一，享誉世界，在中国食品行业和文化氛围中也占有重要的地位[1]。中国白酒主要以支链淀粉丰富的高粱、谷物为主要原料，以大曲、小曲或麸曲为糖化发酵剂，采用固态、半固态或液态发酵方式，经蒸煮、发酵、蒸馏、勾调和贮存等工艺制得[2-3]。不同的酿酒原料、地理位置、气候条件、生产工艺造就了中国白酒香型、口感、品质及风味迥异的特点[4]。

中国白酒行业中流传着“粮乃酒之肉，曲乃酒之骨”说法，大曲作为一种以小麦为原料所制得的发酵培养基，在白酒生产过程中担任“微生物制剂、复合酶制剂和风味物质载体”等角色，对白酒的生产起到至关重要的作用[5]。大曲不仅有助于高粱发酵过程中淀粉的降解及乙醇的产生，还决定了白酒最终的风味，一方面，主要是因为大曲中含有多种能水解和发酵底物的微生物和所分泌酶，在温度、湿度满足生长的条件下，分解谷物生成酒精；另一方面，大曲品质很大程度上取决于成分配方和微生物菌群组成，这些因素因产地而异，赋予发酵酒独特的风格和品质[6]。本文主要阐述酱香大曲功能微生物菌群及分泌酶系等方面内容，旨在为大曲微生物的研究提供一定的理论参考，促进白酒大曲的生产研究和品质提升。

1 酱香大曲功能微生物菌群

酱香型白酒的生产遵循“12987”和“四高”的生产原则，即一年一个生产周期，两次投料发酵，九次蒸煮，八次发酵，七次摘酒，高温制曲、高温堆积、高温发酵和高温摘酒，其中高温制曲是酱香型白酒生产的一大特点。目前，酱香型白酒高温大曲生产环境相对开放，确保发酵温度适合大曲发酵，而制曲环境中空气、稻草、原料和器皿中微生物都可能参与发酵，成为大曲中必需微生物。大曲中主要有3类微生物，分别是细菌、丝状真菌（霉菌）和酵母菌，此外还含有部分放线菌，但放线菌作用功能目前尚不明确[7]。不同酱香大曲中微生物菌群结构如表1所示。

1.1 酱香大曲中的霉菌种类及作用

通常，酱香型白酒高温大曲中霉菌主要可分为根霉（Rhizopussp.）、毛霉（Mucorsp.）和曲霉（Aspergillussp.）3 大类，白酒酿造中涉及丰富的霉菌参与发酵，其中以根霉和毛霉为主。米根霉是酱香大曲中主要根霉，其菌丝一般多核且呈分支状，菌丝之间没有明显的隔膜，在大曲和白酒发酵过程中产生乙醛、正丙醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯等芳香族成分而广为研究者们所关注[20]；而曲霉属于丛梗孢科中的一类，菌丝呈褐、黑、黄、白等颜色，在种类众多的曲霉微生物中，黑曲霉作为大曲中大量存在的霉菌，已被诸多学者证明其具有分泌多种活力较强的酶系，一方面霉菌的功能是参与谷物原料中淀粉的糖化、液化；另一方面可产生发酵所需的多种酶类，如糖化酶、α-淀粉酶和蛋白酶等，推动大曲发酵成熟，有助于降解大曲原料淀粉，并一定程度上防止曲块挂衣差、裂口与死板等现象[21-22]。

关于酱香大曲中霉菌的研究诸多，如陈笔[23]通过涂布平板法和PCR-DGGE 技术对贵州某酱香型白酒厂大曲曲粉进行检测，两种方法均检测到Aspergillus terreus、Aspergillus oryzae和Paecilomyces variotii3 种霉菌，且Aspergillus oryzae和Paecilomy-ces variotii为白酒发酵过程中优势菌；LIU 等[24]通过DGGE 技术在酱香型大曲中检测并分离到M.racemosus和T.crustanceus两种霉菌。班世栋等[25]从贵州省某酒厂酱香大曲中分离得到19 株霉菌；目前，通过可培养和未培养的方式，从酒曲中分离得到的霉菌主要为7 类约50 种，分别为Aspergillussp.，Absidiasp.，Rhizomucorsp.，Rhizomucorsp.，Mucorsp.，Penicilliumsp.和Monascussp.[23]。WANG 等[26]通过PCR-DGGE 技术在中国白酒大曲酿造微生物中检测到Rhizomucor miehei、Absidia blakesleeana、Aspergillus oryzae和Aspergillus terreus4 株霉菌等。

1.2 酱香大曲中的酵母菌种类及作用

酵母菌（Saccharomyces sp.）是大曲发酵的原动力，在大曲发酵过程中发挥着重要的作用。通常，酵母菌以出芽的无性繁殖方式为主，在高温大曲中主要起到酒化和酯化的作用，不同类型的酵母菌决定不同风格的大曲，进而影响白酒的品质和风格[21]。酱香大曲中含有丰富的酵母菌，主要包含酿酒酵母、假丝酵母、产酯酵母等。不同种类的酵母菌可以分泌活性强的酒化酶和酯化酶，促使谷物中的淀粉分解为葡萄糖，葡萄糖进一步通过糖酵解途径分解为乙醇，并通过合成酯赋予酒体重要的风味物质[27]。

早在2001 年，关于酱香大曲中酵母菌的研究就已开展，茅台酒厂技术中心对茅台酒制曲发酵过程中分离得到18 种酵母菌，包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、假丝酵母（Candidasp.）、丝孢酵母（Trichosporonsp.）、汉逊酵母（Hansenulasp.）、红酵母（Rhodotorulasp.）和毕赤酵母（Pichiasp.）等[28]；吴徐建[29]通过现代分子生态技术探究酱香大曲中酵母菌，结果表明，大曲中分离得到热带假丝酵母、Candida silvae等不同种类的酵母，其中扣囊复膜酵母和异常毕赤酵母是大曲中优势酵母种类，而酿酒酵母虽然在大曲中含量较少，但一定程度上丰富了大曲中酵母种类结构；王旭亮等[30]通过研究发现大曲中含有1 株酵母Sc-1，能够有效缩短大曲发酵时间并提高摘酒酒度，此说明大曲不仅能够提供白酒发酵过程中所需具有发酵力作用的酿酒酵母菌株，还能提供协同促进酿酒酵母完成酒精发酵的其他功能菌；Wu 等[31]通过研究郎酒大曲和酒醅的微生物变化趋势发现，发酵基质堆积初期酵母菌数量上升，但随着发酵时间的推移，酵母菌的数量会下降；罗方雯等[32]对茅台镇酱香型白酒不同酿造区域可培养酵母种群结构多样性研究发现，从大曲中共分离223株酵母，鉴定为12个属、20个种，其中主要优势种为W.anomalus和Saccharomycopsis fibuligera，此外Nectaromyces rattus、Wickerhamomycessp.H1Y23、Issatchenkiasp.S612Y5、Wickerhamomyces pijperi、Trichosporon faecale、Kazachstaniasp.IMB190R、Pseudozymasp.、Kazachstania solicola、Torulasporasp.Z8Y10 和Helicoceras oryzae为首次从酱香型白酒酿造过程中分离获得的酵母菌株。

表1 部分酱香型白酒大曲微生物研究近况

续表1 部分酱香型白酒大曲微生物研究近况

1.3 酱香大曲中的细菌种类及作用

高温大曲发酵过程中，其发酵形成方式除依赖霉菌之外，多数还依靠耐高温细菌。耐高温细菌主要包括乳酸菌（Lactic acid bacteria）、芽孢杆菌（Ba-cillussp.）、醋酸菌（Saccharomycessp.）等。研究发现，在酱香型白酒高温大曲的发酵和糖化过程中，以小麦为原料的高温大曲微生物细菌可以降解淀粉和蛋白质，生成氨基酸和发酵型糖类，所以耐高温细菌是酱香物质产生的重要因素之一。此外，酱香大曲中乳酸菌会消耗和利用大曲原料中营养物质产生大量的乳酸，在酶的作用下进一步与乙醇生成乳酸乙酯，乳酸乙酯的含量过高，一定程度上会影响白酒酒体的风格和品质。白酒酒体中常见的异味，如馊味、涩味和酸味等，与大曲参与混合发酵有密切的联系，换而言之，大曲中乳酸菌含量的多少是衡量大曲品质的一个重要的指标；醋酸菌是大曲产酸的主要菌群之一，能氧化葡萄糖和乙醇，生成乙酸，并进一步与醇反应生成酯类化合物[21]。探究醋酸菌的种类、数量及发酵特点有利于合理控制制曲发酵进程；而芽孢杆菌作为细菌的一类，属于需氧菌，适宜在偏酸性、潮湿的环境中生存，在大曲发酵过程中，也起到至关重要的作用。

关于酱香大曲中细菌菌群的种类及分布的研究较多，例如，任爱容[15]通过高通量测序结合数理分析方法首次在酱香大曲中检测出细菌21 个门和532 个属，首次检出解硫胺素芽胞杆菌属（Aneurinibacillus）、鲁梅尔芽胞杆菌属（Rummeliibacillus）、摩根氏菌属（Morganella）、普劳斯氏菌属（Prauserella）、橄榄形菌属（Olivibacter）、库特氏菌属（Kurthia）、两面神菌属（Janibacter）、巴尔通氏体属（Bartonella）、香味菌属（Myroides）、Parapusillimonas和unclassified_o__Corynebacteriales；此外，随着酱香大曲的发酵，细菌多样性下降，优势菌群变化明显，其中芽孢杆菌属（Bacillus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、片球菌属（Pediococcus）、魏斯氏菌属（Weissella）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）是母曲和翻仓曲的优势菌群，而出仓曲的主要菌群为芽孢杆菌属（Bacillus）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）[33]。酱香大曲的发酵情况与环境条件密不可分，其二者所含细菌菌群的种类也不同，根据连续七个轮次的大曲和酿造环境样品的分布频率和优势度分析表明，Bacillus、Lysinibacillus、Staphylococcus和Micrococcus为酿造大曲中的核心可培养细菌，Bacillus、Staphylococcus、Micrococcus和Alcaligenes为环境中的核心可培养细菌，而Bacillus、Staphylococcus和Micrococcus为大曲和环境样品中共有的可培养核心细菌，各轮次大曲与环境样品中细菌种类存在差异，但主要细菌菌群结构基本保持一致[34]。综上所述，可培养优势细菌一方面为茅台镇酱香型白酒酿造提供了丰富的生物性资源、丰富的酿造酶系结构，调控重要风味形成；另一方面为高品质的酱香白酒酿造提供了净化、安全的基础环境条件。

2 酱香大曲主要功能酶系

2.1 淀粉酶类及功能

在酱香型白酒发酵过程中，大曲作为重要的复合酶制剂，参与谷物原料中淀粉降解为糊精，进而产生酒精，其中淀粉酶作为降解淀粉的“主力军”。糖化型淀粉酶能够降解谷物原料中淀粉的α-1,4 型和α-1,6 型糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖等可发酵性糖[35]，由于淀粉酶种类较多，根据淀粉酶水解淀粉作用的糖苷键位置和反应的端基基团的不同，可分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶等，白酒发酵过程中以α-淀粉酶为主[36]。通常条件，因作用温度的不同，α-淀粉酶可分为低温α-淀粉酶、中温α-淀粉酶和耐高温α-淀粉酶，作用条件为40～70 ℃、pH 6.0～7.0。研究表明，合理控制淀粉酶含量可以提高发酵糖的生产速率，有效调控白酒中高级醇的含量，提高白酒出酒率[37]。宗绪岩等[38]通过模拟白酒固态发酵的方式，添加活性干酵母0.8 %、糖化酶1000 U/g、α-淀粉酶50 U/g 时，高级醇总量比空白降低了21.06 %，合理调控了高级醇的含量，提高白酒的品质。

2.2 蛋白酶类及功能

蛋白酶类是机体内能够有效水解蛋白质肽键的一类酶系总称，能够有效的分解机体内蛋白质产生相应的营养物质。根据反应最适pH 值，可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。研究表明，在酒曲发酵过程中，一方面，曲块会生酸，故酸性蛋白酶在白酒发酵过程中作用较大，其作用条件为40 ℃、pH2.5～4.0；另一方面，蛋白酶与白酒风味物质的形成有密切的联系，其中主要是蛋白质的降解物氨基酸决定很多白酒风味物质[39-40]。孙金旭等[41]通过单因素试验探究蛋白酶对酱香型白酒发酵过程中异戊醇（杂油醇）生成的影响，结果表明，当蛋白酶添加量为20 U/g 时，白酒中异戊醇含量降低89.80 %，说明蛋白酶是酱香型白酒中异戊醇生成的主要影响因素，合理控制蛋白酶含量可以有效控制白酒酒体的异常。CATARINA 等[42]通过向含氮量较低的发酵体系中加入磷酸氢二铵或氨基酸类物质。研究发现，异戊醇的合成会因为总氮含量的增加而明显降低，但是正辛醇的含量却有所降低。此外，在酱香型白酒酿造过程中，高温大曲质量的差异会影响白酒的酒质和口感，筛选优质的高温大曲的主要标志是蛋白水解酶的活性，一定条件下，蛋白酶的酶解反应和还原糖作用生成高含量、多种类的化合物，保证曲香浓郁、优雅纯正[43]。

2.3 糖化酶类及功能

糖化酶又称葡萄糖淀粉酶，其功能是水解淀粉中的α-1,4型和α-1,6型糖苷键，有效的将淀粉转化为葡萄糖，进而生成乙醇。糖化酶活性与淀粉利用率成正比，糖化酶活性越高，淀粉利用率则越高。通常，糖化酶的最适反应条件为pH4.0～4.5，但当pH 值低于2.5 时，糖化酶也会保持一定酶活性，所以糖化酶适宜在白酒发酵过程中酸度不断增加的情况[44]。鲁珍等[45]对前期高温大曲中8 株产酱香菌株进行产糖化酶筛选，通过形态观察及16S rDNA序列同源性分析，得到名为Bacillus cereus的产糖化酶能力最强菌株，然后进行单因素和正交试验优化后，其产物糖化酶活力高达917.03 U/g；周天银等[46]通过添加糖化酶的方式，使成品酒中的杂醇油的含量全部有效的控制在0.18 g/100 mL以内，同时提高出酒率0.96 %。赵金松等[47]在小曲白酒发酵的传统工艺中加入了适量糖化酶，代替小曲作为糖化发酵剂，结果表明，糖化酶不仅提高原料的淀粉利用率，也使淀粉的糖化进行得更加彻底，提高了原料的出酒率。

2.4 纤维素酶类及功能

纤维素酶是指可以有效的水解β-1,4 型糖苷键成为纤维二糖和葡萄糖的一类酶系的总称，通常是由内切葡萄糖苷酶（EG）、纤维二糖水解酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶（BG）共同组成。纤维素酶可以将原料中的淀粉、纤维素和半纤维素转化为可发酵性糖，进而经酵母协同转化为酒精，提高出酒率。研究表明，纤维素酶的添加可以有效的提高白酒酒体质量和酒糟利用率。李旭晖等[48]研究固态发酵工艺中纤维素酶对大曲酒中醇、醛、酸、酯等风味物质的影响发现，当纤维素酶添加量为10 FPU/kg时，所产酒中醛类及杂醇油等含量降低，而四大酯及对应酸含量升高；当纤维素酶添加量为30～50 FPU/kg时，所产酒口感良好、风格突出；杨建梅等[49]通过甲基磺酸乙酯（EMS）连续诱变后，获得从大曲中筛选出1 株高产纤维素酶诱变菌株RY49，利用RY49 制备出功能性纤维素酶帘子曲，并应用到白酒丢糟中，其出酒率（60 %vol 糟酒/100 kg 丢糟）达到了3.89%，有效提升了丢糟的经济价值。

3 结论和展望

随着科学技术的不断发展，白酒香型的研究广为延伸，有关大曲微生物及其酶系的研究也越来越深入，大量科研工作者们对酒曲中细菌、霉菌和酵母等研究，揭开了白酒酿造过程的神秘面纱。大曲中微生物是决定白酒香型特点的主力军，白酒发酵又是多种微生物菌系及酶系共同作用的结果。目前，对于酱香大曲中微生物和白酒发酵酶系呈系统化深入认识比较少，后续有待于系统化揭秘白酒固态发酵机理。此外，保证白酒发酵过程中菌系、酶系及物系的相互作用，用于提高和突出白酒酒体质量和风格是广大白酒科研工作者们共同努力的目标。