芦丁对溃疡性结肠炎小鼠的干预作用及NLRP3炎症小体的影响

岳朝驰,杨向东,李 俊,陈小朝,李远志

(1. 西南医科大学附属医院，四川 泸州 646000;2. 成都肛肠专科医院/中国PPH培训中心，四川 成都 610015 )

溃疡性结肠炎是炎症性肠病的一种类型，患者主要表现为腹泻、黏液或脓血便、腹痛、里急后重等，病程容易迁延，导致患者生活质量下降，给患者带来巨大痛苦并且给社会带来很大的经济负担[1]。该病病因不明，确切发病机制尚未完全明确，世界卫生组织(WHO)已将其列为现代难治病的行列，因此寻找其发病机制和防治手段迫在眉睫。 目前对溃疡性结肠炎的主流治疗药物是西药氨基水杨酸、免疫抑制剂及糖皮质激素，短期治疗可改善症状，但长期应用不良反应大，停药易反复。而新型生物制剂等分子靶向药物因其疗程长、价格昂贵等原因，目前在我国广泛推广应用不现实[2]。传统中医中药治疗溃疡性结肠炎有一定优势，可降低复发率[3-4]。槐花是一味传统中药，是豆科植物槐(SophorajaponicaL.)的花和干燥的花蕾，具有凉血止血、清泻血分热的功效，其提取物具有抗氧化作用[5]。芦丁是槐花的有效成分之一，其可以提高毛细血管稳定性，降低毛细血管通透性，可用于高血压、血小板减少性紫癜、脑出血等疾病的防治[6]。本实验观察了芦丁对溃疡性结肠炎的干预作用，并探讨了其作用机制是否与NLRP3炎症小体有关，旨在为其临床应用提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1动物 SPF级C57BL/6J雄性小鼠60只，购买于成都达硕实验动物有限公司，体质量(20.2±2)g，动物合格证号：SCXK(川)2018-37。分笼饲养，每笼10只。饲养环境：SPF动物房内中央空调持续通风，维持室温22～26 ℃，相对湿度50%～65%，白天(6:00—18:00)保持日光灯照明，夜间(18:00—次日6:00)关灯。

1.2药品与试剂 芦丁(芸香苷，纯度>98%)，美国Sigma公司；美沙拉嗪缓释颗粒(商品名：艾迪莎)，上海爱的发制药有限公司，国药准字H20143164；葡聚糖硫酸钠(DSS，相对分子量40 000),美国Sigma公司；白细胞介素-1β(IL-1β)试剂盒(小鼠ELISA)，中国欣博盛生物科技有限公司；白细胞介素-18(IL-18)试剂盒(小鼠ELISA)，中国欣博盛生物科技有限公司；BCA蛋白浓度试剂盒,美国PIERCE公司； 预染蛋白分子marker，美国MBI公司；PVDF膜，美国MILLIPORE公司；内参β-actin单克隆(兔抗小鼠)抗体，CST公司；NLRP3单克隆(兔抗小鼠)抗体，CST公司；Cleaved caspase-1单克隆(兔抗小鼠)抗体，CST公司；Cleaved IL-1β单克隆(兔抗小鼠)抗体，CST公司；HRP标记(山羊抗兔)抗体,中国碧云天公司。

1.3仪器设备 垂直电泳仪(美国伯乐公司)；电转膜仪(美国伯乐公司)；qRT-PCR仪(加拿大枫岭公司)；Gel Doc 1000 凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)；分光光度仪(德国Sartorious公司)；水平摇床(美国Thermo公司)；光学显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.4分组、造模及干预 采用随机平行对照法将60只小鼠分为空白组、模型组、美沙拉嗪组和芦丁高、中、低剂量组，每组10只。空白组不造模，其余组均制备溃疡性结肠炎模型：将DSS溶入蒸馏水配制成3%DSS溶液(每日现配现用)，每天及时更换，不能出现明显浑浊，自由饮用5 d，每日统计小鼠饮用量。于造模当天开始，芦丁高、中、低剂量组分别给予100 mg/(kg·d)、50 mg/(kg·d)、25 mg/(kg·d)芦丁溶液(1%羧甲基纤维素钠作为溶剂)灌胃， 美沙拉嗪组给予美沙拉嗪缓释颗粒灌胃[小鼠用量(g/kg)=人每天口服药量(g)×0.002 6/0.02 kg]，空白组、模型组给予等体积1%羧甲基纤维素钠溶液灌胃，均连续5 d。

1.5检测指标及方法

1.5.1疾病活动度(DAI)评分 每天用电子天平称量小鼠体质量，观察小鼠的粪便性状(软便、糊状便或稀水便)，用联苯胺法检测大便隐血情况。根据小鼠粪便和体质量变化情况完成DAI评分，0分：体质量无下降，大便性状正常，无肉眼血便，大便隐血阴性；1分：体质量下降1%～5%，大便松散，大便隐血阳性；2分：体质量下降5%～10%，软便，大便隐血阳性；3分：体质量下降10%～15%，糊状便，大便隐血阳性；4分：体质量下降>15%，水样便，肉眼血便。

1.5.2组织病理学HE染色观察和组织学评分 实验结束处死各组小鼠，多聚甲醛固定小鼠结肠组织24 h，常规包埋切片后HE染色。每张HE染色切片随机选择3个视野进行组织学评分，观察黏膜完整性，肠壁是否水肿，炎细胞尤其淋巴细胞浸润情况，是否存在隐窝炎和隐窝脓肿，计算杯状细胞数量，观察病变是否穿透黏膜层并累及肌层。由2位病理科专科医师依据以上标准，按双盲原则评分，取其平均值。 0分：无炎症和隐窝损害；1分：轻度炎症，累及黏膜层，约1/3隐窝受损，损伤面积1%～25%；2分：中度炎症，累及黏膜层和黏膜下层，约2/3隐窝受损，损伤面积26%～50%；3分：重度炎症，累及黏膜全层，隐窝缺失、表面上皮存在，损伤面积51%～75%；4分：隐窝及表面上皮均缺失，损伤面积76%～100%。

1.5.3外周血清和结肠组织中IL-1β和IL-18水平 实验结束后麻醉小鼠，眼眶采血法取血约2 mL，2 000 r/min离心20 min，收集上清，按组分装标记后放置于-20 ℃冰箱备用。取3 mm×1 mm×1 mm结肠组织放入组织匀浆器中，加入适量PBS冰上研磨后于低温离心机中12 000×g离心20 min，取上清液按小鼠组别分装标记后放置-80 ℃备用。按ELISA试剂盒说明书检测血清和结肠组织匀浆上清液中IL-1β和IL-18水平。

1.5.4结肠组织中NLRP3和IL-1 βmRNA表达量通过试剂盒提取小鼠结肠组织mRNA，采用qRT-PCR检测各组小鼠结肠组织中NLRP3和IL-1β mRNA相对表达量。采用Primer5软件设计目的基因NLRP3、IL-1β和内参基因β-actin的上游引物和下游引物：NLRP3上游引物为5’- AGAAGAGACCACGGCAGAAAG -3’，下游引物为5’-CTTGGAACCAGGTTGAGTGT-3’；IL-1β上游引物为5’-GTCTTTCCCGTGACCTTC- 3’,下游引物为5’-ATCTCGGAGCCTGTTAGTGC-3’；β-actin上游引物为5’-ACCTCTATGCCAACACAGTG-3’，下游引物为5’-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3’。于FTC2000实时荧光定量PCR仪内进行实时定量PCR扩增，目的基因与内参基因循环阈值的差异为目的基因转录产物mRNA的相对表达量,实验重复3次。

1.5.5结肠组织中NLRP3、Cleaved caspase-1、Cleaved IL-1β蛋白表达水平 采用Western blot法检测：提取小鼠结肠组织蛋白样本，BCA法检测蛋白浓度，蛋白质SDS-PAGE电泳后，经过转膜、封闭、一二抗孵育，凝胶成像仪显影。分析各组目的蛋白NLRP3、Caspase1、IL-1β条带灰度值与内参β-actin灰度值的比值(蛋白表达相对灰度值),实验重复3次。

2 结 果

2.1各组小鼠一般情况和DAI评分比较 模型组小鼠造模第2天开始出现懒动，体毛凌乱和精神萎靡，其中2只小鼠出现大便隐血阳性；造模3 d后，小鼠开始出现明显腹泻、大便隐血或血便、体质量逐步减轻等临床症状。芦丁高、中剂量组和美沙拉嗪组小鼠也出现了溃疡性结肠炎临床表现，但程度较模型组轻。造模第5天，空白组、模型组、美沙拉嗪组和芦丁高、中、低剂量组DAI评分分别为0分、(3.92±0.64)分、(1.42±0.24)分、(1.53±0.45)分、(2.45±0.52)分、(3.33±0.43)分，模型组明显高于空白组(P<0.05)，芦丁高、中剂量组和美沙拉嗪组均明显低于模型组(P均<0.05)，芦丁高剂量组和美沙拉嗪组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2各组小鼠结肠病理组织病理表现及组织学评分比较 HE染色光镜下见空白组小鼠结肠组织黏膜正常；模型组小鼠结肠组织黏膜明显充血、水肿，有糜烂脱落、重度糜烂和多个呈圆形或椭圆形的溃疡，溃疡边缘充血水肿，周围炎细胞浸润；美沙拉嗪组和芦丁高、中、低剂量组小鼠结肠组织病变轻于模型组，以美沙拉嗪组和芦丁高剂量组显著，见图1。空白组、模型组、美沙拉嗪组和芦丁高、中、低剂量组组织学评分分别为(0.49±0.25)分、(3.32±0.82)分、(1.02±0.34)分、(1.13±0.48)分、(1.87±0.24)分、(2.83±0.63)分，模型组明显高于空白组(P<0.05)，芦丁高、中剂量组和美沙拉嗪组均明显低于模型组(P均<0.05)，芦丁高剂量组和美沙拉嗪组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 各组小鼠结肠组织HE染色表现(×100)

2.3各组小鼠外周血和结肠组织中IL-1β和IL-18水平 模型组小鼠血清和结肠组织中IL-1β和IL-18水平均明显高于空白组(P均<0.05)，芦丁高、中、低剂量组和美沙拉嗪组均明显低于模型组(P均<0.05)，且芦丁高剂量组均明显低于美沙拉嗪组(P均<0.05)。见图2。

图2 各组小鼠外周血和结肠组织中IL-1β和IL-18水平

2.4各组小鼠结肠组织中NLRP3和IL-1β mRNA表达量比较 模型组小鼠结肠组织中NLRP3和IL-1β mRNA表达量均明显高于空白组(P均<0.05)，芦丁高、中剂量组和美沙拉嗪组均明显低于模型组(P均<0.05)，且芦丁高剂量组均明显低于美沙拉嗪组(P均<0.05)。见图3。

图3 各组小鼠结肠组织中NLRP3和IL-1β mRNA表达量

2.5各组小鼠结肠组织中NLRP3、Cleaved caspase-1和Cleaved IL-1β蛋白表达水平比较 模型组小鼠结肠组织中NLRP3、Cleaved caspase-1和Cleaved IL-1β蛋白表达水平均明显高于空白组(P均<0.05)，芦丁高、中剂量组和美沙拉嗪组均明显低于模型组(P均<0.05)，且芦丁高剂量组均明显低于美沙拉嗪组(P均<0.05)。 见图4及图5。

图4 各组小鼠结肠组织中NLRP3、Cleaved caspase-1和Cleaved IL-1β 蛋白表达条带

图5 各组小鼠结肠组织中NLRP3、Cleaved caspase-1和Cleaved IL-1β 蛋白表达水平

3 讨 论

溃疡性结肠炎主要表现为弥漫性连续性分布的慢性非特异性炎症和溃疡，可累及远端结肠黏膜，也可向近端结肠发展。多数溃疡性结肠炎反复发作并呈慢性发展，部分患者有累及结节性红斑、眼葡萄膜炎、外周关节炎等肠外表现。溃疡性结肠炎患者后期因营养不良可出现贫血、低蛋白血症、体质量减轻等表现，甚至会并发下消化道大出血、肠穿孔、中毒性巨结肠等严重并发症，需及时采取外科手术治疗[7-8]。

中医没有溃疡性结肠炎的病名，《黄帝内经》中记载了“肠澼”，并有“下白沫”“下脓血”等描述，这与溃疡性结肠炎的急性期症状一致。《伤寒杂病论》中记载“下利已差，至其年、月、日、时复发者，以病不尽故也”，这与溃疡性结肠炎反复发作、病情缠绵、迁延不愈的病情特点一致。目前大量研究表明中西医结合长期治疗可改善溃疡性结肠炎患者的临床症状，降低复发率[4]。

槐花作为药物始载于《日华子本草》，至今已有上千年的药用历史。明代《本草原始》中记载“肠风泻血赤白痢并炒研服，凉大肠炒香”；《炮炙大法》指出槐花“若止血，炒黑”。现代药物研究显示，槐花含有黄酮、鞣质、氨基酸、植物甾类、烯酸及微量元素等多种有效成分，并鉴定出芦丁为槐花的主要药理成分[6]。芦丁可诱导血小板集聚，缩短凝血时间，有一定的抗炎、抗氧化应激、抗衰老、抗辐射、抗病毒和提高免疫力等作用，且毒性低[9]。目前，槐花一般以芦丁作为定量的标准。故本实验选择芦丁进行研究，结果显示芦丁高、中剂量组小鼠临床表现较模型组轻，DAI评分明显低于模型组；HE染色显示，芦丁各剂量组小鼠炎症细胞浸润明显减少，结肠的架构修复完整，没有明显溃疡，且芦丁高、中剂量组组织学评分明显低于模型组。上述结果提示芦丁对溃疡性结肠炎模型小鼠具有一定的治疗作用。

目前研究认为，IL-1β可广泛调节各类炎症细胞趋化浸润，其水平与溃疡性结肠炎活动性呈明显的正相关性，抑制IL-1β与受体结合可以减轻溃疡性结肠炎模型小鼠的肠道炎症和临床症状[10]。与IL-1β类似，IL-18同样是NLRP3炎症小体信号下游重要的靶蛋白，NLRP3炎性小体活化可诱导IL-18成熟和分泌，导致炎性损伤[11]。本实验结果显示，模型组小鼠血清和结肠组织中IL-1β和IL-18水平均明显高于空白组，芦丁高、中、低剂量组和美沙拉嗪组均明显低于模型组，且芦丁高剂量组更低。提示IL-1β和IL-18属于致病性炎症介质，与结肠局部及全身炎症状态、肠黏膜溃疡出血等正相关；芦丁可抑制IL-1β和IL-18成熟和释放，阻断其介导的炎症级联反应而减轻溃疡性结肠炎病情。

NLRP3炎性小体活化与溃疡性结肠炎的发病密切相关[12]。相关动物模型研究发现，相较于野生型动物，NLRP3基因敲除/敲降动物对DSS/TNBS诱导的溃疡性结肠炎均更易感，肠道屏障完整性容易被破坏，肠上皮细胞增殖能力减弱和黏膜损伤程度更严重[13]，据此认为NLRP3炎性小体在溃疡性结肠炎发病中起保护作用[14]。然而有些研究认为NLRP3炎症小体活化可诱导肠道黏膜炎症性损伤，加速溃疡性结肠炎的致病，而NLRP3基因敲除或缺陷动物或抑制NLRP3炎症小体激活可缓解DSS诱导的溃疡性结肠炎临床症状[15]。本实验结果显示，模型组小鼠结肠组织中NLRP3 mRNA表达量、IL-1β mRNA表达量和NLRP3、Cleaved caspase-1、 Cleaved IL-1β蛋白表达水平均明显高于空白组，芦丁高、中剂量组和美沙拉嗪组上述指标均明显降低，且芦丁高剂量组更低。证明溃疡性结肠炎状态下NLRP3炎症小体被激活，芦丁可抑制NLRP3炎症小体活化。综上所述，芦丁可有效改善DSS诱导的结肠炎症损伤，可能是溃疡性结肠炎防治潜在的候选药物，其作用机制可能与抑制NLRP3炎症小体活化有关。由于条件所限，未继续探索芦丁对NLRP3基因敲除/过表达小鼠溃疡性结肠炎模型的作用，有待验证。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。