miRNA-592在肾细胞癌进展中作用及其与预后关系研究

陈 勇， 邓 美， 邹 飞， 彭 拓， 傅 饶， 张 洋

重庆三峡医药高等专科学校附属医院 泌尿外科，重庆 404100

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是肾常见的肿瘤之一，约占所有成人恶性肿瘤的3%[1]。约有1/3的RCC患者在诊断时已发生转移，且对放化疗不敏感，预后较差[2]。深入分析RCC的生物学标志物并寻找潜在治疗靶点，对早期诊治并改善生存预后有重要价值。miRNA与细胞增殖、分化、侵袭和凋亡等生物学行为密切相关，在肿瘤发生和发展中起到重要作用[3-4]。miRNA对肿瘤的早期诊断、治疗和预后评价有一定价值[4]。miRNA-592在多种癌症中异常表达，如miRNA-592在肝癌组织中低表达，可能通过靶向DEK基因抑制肝癌细胞的增殖[5]；在胶质瘤组织中低表达，通过靶向IGFBP2抑制胶质瘤细胞的增殖与侵袭，促进凋亡[6]。但也有研究表明，miRNA-592在结直肠癌细胞中高表达，抑制其表达可降低癌细胞的增殖和迁移[7]。本研究检测RCC组织和细胞中miRNA-592的表达，通过沉默miRNA-592观察细胞增殖与凋亡的变化，并分析miRNA-592与RCC预后的关系。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验试剂 DMEM培养基和胎牛血清购于上海复祥生物科技有限公司，反转录试剂盒与2×SYBR Green PCR Mastermix试剂盒购于美国Sigma公司，引物均由广州伯信生物科技有限公司设计并提供，BCA蛋白定量试剂盒和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)快速制备试剂盒购于上海语纯生物科技有限公司，CCK-8试剂盒和凋亡检测试剂盒购于上海语纯生物科技有限公司，Cyclin B1、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和GAPDH内参抗体购于美国Sigma公司，Bax和Cleaved caspase-3抗体购于英国Abcam公司。正常人肾上皮细胞系(HK-2)和人RCC细胞系(786-O、ACHN、Caki-1和769-P)购于中科院上海细胞库。在含10%胎牛血清、链霉素100 μg/ml及青霉素100 U/ml的DMEM培养基中进行培养，培养条件为37℃、5%CO2。当细胞融合度达80%时进行传代。

1.1.2 组织样本 选取2011年2月至2012年12月重庆三峡医药高等专科学校附属医院泌尿外科手术切除的110例RCC患者的RCC组织及其配对的癌旁组织(距离癌组织≥5 cm)，患者术前均未接受放疗、化疗或免疫治疗。患者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 逆转录-聚合酶链反应检测组织和细胞中miRNA-592的表达水平 用TRIzol法提取组织和细胞中的总RNA，通过反转录获取cDNA，随后用荧光定量试剂盒进行检测，反应条件：加热95℃，时间30 min，变性94℃ 15 s，退火55℃ 30 s，延伸70℃ 30 s，共40个循环。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，用2-△△Ct法计算miRNA-592相对表达量。引物序列：miRNA-592上游-3′-CGAGCTGAGTGCGTCCTGTC-5′；下游5′-TCGCTGGCCGTGAGTCTGT-5′；U6上游5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′；下游5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。

1.2.2 转染 用LipofectAMINETM 2000试剂盒将miRNA-592沉默质粒(sh-miRNA-592组)或空载体质粒(sh-NC组)转染入转染786-O细胞。首先制备LipofectAMINETM 2000复合物和DNA复合物，DNA复合物包括4 μg浓度为1 μg/μl的质粒与246 μl的无血清培养基。随后将两种复合物混匀，温室静置15 min。将混合物加入细胞培养板，温室孵育6 h后更换含血清的培养基，继续培养48 h。转染24 h后进行后续研究。

1.2.3 克隆形成实验 用胰蛋白酶消化转染后的786-O细胞，将其接种于细胞培养板中进行培养，培养条件为37℃、5%CO2，培养3周。出现菌落时停止培养，用4 %多聚甲醛固定并进行结晶紫染色，显微镜下计算克隆细胞数。

1.2.4 CCK-8法检测786-O细胞增殖能力 用CCK-8试剂盒检测786-O细胞活性，细胞培养24、48、72、96 h时，用酶标仪在490 nm波长处读取吸光度，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.5 Annexin-V-FITC/PI流式细胞术检测786-O细胞凋亡情况 转染后取对数生长期细胞，用500 μl预冷1倍结合缓冲液将786-O细胞制成1×106个/ml的悬液。加入5 μl异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)，混匀后37℃、5%CO2培养10 min；随后加入2.5 μl碘化丙啶(propidium iodide，PI)，孵育5 min。最后用流式细胞仪检测786-O细胞凋亡率。

1.2.6 免疫印迹法检测786-O细胞增殖和凋亡相关蛋白 首先用RAPI裂解液提取细胞中的总蛋白，包括细胞增殖相关蛋白(Cyclin B1、PCNA)和凋亡相关蛋白(Bax、Cleaved caspase-3)。用BCA试剂盒检测蛋白浓度，10%SDS-PAGE分离蛋白，半干转移法将蛋白转至聚偏二氟乙烯膜上。随后用5 %脱脂奶粉封闭2 h，加入Cyclin B1(1∶1 000)、PCNA(1∶500)、Bax(1∶500)、Cleaved caspase-3(1∶500)抗体4℃过夜孵育，第2天用TBST缓冲液洗涤3次后加入二抗，封闭1 h。ECL发光仪进行蛋白成像，Image J软件分析灰度值。

2 结果

2.1 miRNA-592在RCC组织和细胞中的表达 癌组织中miRNA-592相对表达量为(2.34±0.47)，明显高于癌旁组织的(0.97±0.41)，差异有统计学意义(P<0.05)。HK-2细胞的miRNA-592相对表达量为(1.01±0.08)，低于786-O细胞(3.84±0.47)、ACHN细胞(2.76±0.53)、Caki-1细胞(1.98±0.12)和769-P细胞(2.45±0.52)，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2 miRNA-592与RCC临床病理特征及预后的关系 以miRNA-592表达中位数为截断值，将110例RCC患者分为高表达组和低表达组，每组55例。两组的T分期患者比例比较，差异有统计学意义(P<0.05)。两组的年龄、肿瘤位置、组织类型、淋巴结转移和远处转移比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。110例RCC患者中位随访时间为50.6个月，随访期内32例患者因各种原因死亡。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，miRNA-592高表达患者的存活率低于低表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

表1 miRNA-592低表达组、高表达组的临床病理特征比较/例(百分率/%)

图1 miRNA-592高表达、低表达组患者生存曲线

2.3 沉默miRNA-592对786-O细胞增殖和凋亡的影响 sh-miRNA-592组miRNA-592相对表达量为(1.01±0.12)，低于sh-NC组的(3.14±0.23)，差异有统计学意义(P<0.05)。sh-miRNA-592组细胞培养48、72和96 h时细胞增殖检测光密度值均低于sh-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。sh-miRNA-592组细胞克隆数为(51.13±15.03)个，低于sh-NC组的(100.45±38.16)个，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。sh-miRNA-592组细胞凋亡率为(16.59%±4.01%)，高于sh-NC组的(5.99%±1.30%)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2～4。

图2 sh-miRNA-592组细胞培养48、72和96 h时细胞增殖光密度值

图3 菌落形成实验检测细胞增殖

图4 Annexin-V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡(a.sh-NC组；b.sh-miRNA-592组)

2.4 沉默miRNA-592对786-O细胞增殖和凋亡相关蛋白的影响 sh-miRNA-592组Cyclin B1和PCNA蛋白相对表达量分别为(0.46±0.08)和(0.44±0.06)，均低于sh-NC组的(0.89±0.11)和(1.13±0.16)，差异有统计学意义(P<0.05)。sh-miRNA-592组Bax和Cleaved caspase-3蛋白相对表达量分别为(0.87±0.07)和(1.22±0.12)，均高于sh-NC组的(0.49±0.10)和(0.38±0.07)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图5 沉默miRNA-592对786-O细胞增殖和凋亡相关蛋白的影响

3 讨论

有研究表明，miRNA在癌症中异常表达，并且与疾病进展和生存预后有关[8-10]。在RCC中，许多miRNA已被证实与生存预后有关，例如miRNA-935、miRNA-21和miRNA-200等[11-13]。miRNA-592是近年来发现的新分子，被证实和肝细胞癌、结直肠癌和甲状腺癌有关[7，14-15]。本研究旨在分析miRNA-592在RCC中的表达及其与生存预后的关系。

本研究发现，RCC癌组织中miRNA-592相对表达量高于癌旁组织，人RCC细胞系(786-O、ACHN、Caki-1和769-P)miRNA-592相对表达量均高于正常人肾上皮细胞系(HK-2)，提示miRNA-592可能是RCC的癌基因。但也有研究表明，miRNA-592在肝细胞癌、胶质瘤和甲状腺癌中低表达，可能是抑癌基因[5,15]，说明miRNA-592的表达可能有组织特异性。

本研究结果显示，miRNA-592与RCC的T分期有关，说明miRNA-592可能参与RCC的进展。miRNA-592的生物学机制目前尚未明确，可能通过靶向调控IGF-1R、DEK、LHCGR和NOVA1等基因，参与细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡与周期性死亡，进而参与疾病的发生、发展[5，14-16]。 细胞增殖和凋亡是影响癌症进展的重要生物学机制。既往研究发现，miRNA-592与癌细胞的增殖和凋亡密切相关[6,14]。本研究采用LipofectAMINETM 2000试剂盒将miRNA-592沉默质粒(sh-miRNA-592组)或空载体质粒(sh-NC组)转染入转染786-O细胞，结果显示，沉默miRNA-592后786-O细胞的增殖活力及相关增殖蛋白表达均受到抑制，而凋亡及相关凋亡蛋白表达明显增高，以上说明miRNA-592可能参与RCC进展。本研究还发现，miRNA-592与RCC生存预后有关，miRNA-592高表达患者的存活率低于低表达患者。

综上所述，miRNA-592在RCC中的高表达与不良生存预后有关，沉默miRNA-592可抑制RCC细胞的增殖并促进凋亡。本研究存在一些局限性，例如未检测RCC患者外周血miRNA-592的表达，未检测miRNA-592下游靶分子的变化。miRNA-592可能会成为RCC的分子生物学标志物，未来需要深入探讨其作用机制。