丹参酮ⅡA抑制软骨细胞炎症、软骨基质降解的机制及对大鼠骨关节炎的影响

张建业，张卫华，韩 俊，陈 东

骨关节炎(osteoarthritis， OA)是一种常见的膝关节疾病，多见于老年患者。OA的主要特征包括软骨退变、关节内炎症和软骨下骨重建[1]。OA的病因尚不清楚，但最近研究表明，炎性细胞因子参与了OA的发生和发展。白细胞介素-1β(IL-1β)在OA的发生发展中起关键作用[2]。IL-1β的释放促进了多种炎性介质和分解代谢因子，如一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶-2(COX-2)、前列腺素E2(PGE2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和基质金属蛋白酶(MMPs)的产生和释放，这些炎性介质和分解代谢因子可导致软骨细胞功能障碍和细胞外基质降解[3-4]。因此，抑制IL-1β和IL-1β诱导的炎症反应可能是治疗OA的有效策略。β-arrestin2是arrestin家族成员之一，在哺乳动物中广泛表达。研究表明，β-arrestin2通过降低炎性介质的表达，参与抑制脂多糖(LPS)诱导的TLR4/NF-κB信号通路激活[5]。虽然甾体类和非甾体类抗炎药可用于治疗OA，但是其不良反应严重，疗效欠佳[6]。因此，具有多种抗炎作用和低毒作用的植物性天然治疗药物越来越受到人们的关注。丹参酮ⅡA(Tan ⅡA)是丹参酮的主要活性成分，其水溶性衍生物可抑制内皮细胞NF-κB信号通路，抑制LPS诱导的炎症反应[7]。此外，Tan ⅡA通过下调促炎症因子的产生减轻LPS诱导的急性肺损伤[8]，提示Tan ⅡA在炎症性疾病治疗中起潜在作用。然而，Tan ⅡA对关节软骨细胞炎症及软骨基质降解的影响及其作用机制尚不清楚。因此，本研究旨在探究Tan ⅡA通过调节β-arrestin2对软骨细胞炎症及软骨基质降解的影响，进一步明确Tan ⅡA对OA大鼠的影响，以期为明确Tan ⅡA在OA中的作用机制提供新的科学资料。

1 材料与方法

1.1材料 大鼠关节软骨细胞和大鼠关节软骨细胞专用完全培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司；Tan ⅡA购自成都普利斯生物科技有限公司；RIPA裂解液和特超敏ECL化学发光试剂盒(BeyoECL Star)购自上海碧云天生物技术有限公司；一氧化氮(NO)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；collagen Ⅱ、p65和基质金属蛋白酶1(MMP1)抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；β-arrestin2、iNOS、Aggrecan和基质金属蛋白酶13(MMP13)抗体购自美国Abcam公司；基质金属蛋白酶3(MMP3)、COX-2和p-p65抗体购自美国Cell Signaling Technology；GAPDH抗体和二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；大鼠PGE2酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；软骨染色液购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2细胞培养 大鼠关节软骨细胞用大鼠关节软骨细胞专用完全培养基，于37℃、5% CO2培养箱中培养。每隔2 d更换1次培养基。

1.3细胞增殖检测软骨细胞活力 将对数生长期大鼠关节软骨细胞接种于96孔板中，5×103个/孔，细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。随后IL-1β(10 ng/ml)处理细胞12 h(IL-1β组)，对照组大鼠添加磷酸缓冲盐溶液。将细胞培养基更换为含有不同浓度Tan ⅡA(6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L，分别作为A、B、C、D、E组)的完全培养基，细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。向每孔细胞内加入CCK-8溶液10 μl，37℃条件下孵育3 h。酶标仪测定450 nm处的吸光值。细胞活力=[(实验组OD450-空白组OD450)/(对照组-空白组)]×100%，OD450为450 nm波长处的吸光度值。

1.4Western blot检测 收集大鼠关节软骨细胞，RIPA裂解液裂解细胞，12 000 r/min 4℃条件下离心取上清，BCA法测定蛋白浓度。取样本蛋白25 μg于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，随后转至聚偏二氟乙烯膜上。10%脱脂奶粉封闭，随后加入一抗iNOS(1︰2000)、COX-2(1︰5000)、MMP1(1︰1000)、MMP3(1︰5000)、基质金属蛋白酶13(MMP13，1︰2000)、Ⅱ型胶原(1︰1500)、Aggrecan(1︰1000)、β-arrestin2(1︰2000)、p-p65(1︰5000)、p65(1︰3000)和GAPDH(1︰10000)稀释液，4℃条件下过夜孵育。TBST清洗后，加入二抗(1︰5000稀释)室温孵育1 h后，滴加BeyoECL Star工作液到膜上，用化学发光成像仪检测。

1.5ELISA检测 对数生长期大鼠关节软骨细胞接种于6孔板中，接种密度为4×105个/ml，细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。按照“1.3”中步骤，向细胞中分别添加IL-1β(10 ng/ml)和Tan ⅡA(25 μmol/L和50 μmol/L)，细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。收集细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测上清液中PGE2含量。

1.6NO含量检测 取对数生长期大鼠关节软骨细胞接种于6孔板中，接种密度为4×105个/ml，细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。按照“1.3”中步骤，向细胞中分别添加IL-1β(10 ng/ml)和Tan ⅡA(25 μmol/L和50 μmol/L)，细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。收集细胞培养上清液，根据NO测定试剂盒说明书检测上清液中NO含量。

1.7OA大鼠模型的建立及给药处理 24只10周龄雄性SD大鼠购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司，实验动物许可证号SCXK(鄂)2016-0011，饲养于无菌环境中，饲养温度(22±2)℃，昼夜交替，提供充足饮水及饲料。待大鼠适应环境1周后，随机分为对照组、模型组和Tan ⅡA组，每组8只。模型组和Tan ⅡA组采用改良Hulth法[9]建立膝骨关节炎大鼠模型，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(2 ml/kg)，于大鼠左髌骨上方正中做一切口，切除内侧半月板及内侧副韧带。对照组大鼠进行相同手术操作，但不切除内侧半月板及内侧副韧带。术后连续3 d予青霉素20万单位肌内注射预防感染。术后1周，Tan ⅡA组大鼠予Tan ⅡA 0.5 mg/kg灌胃[10]，对照组和模型组予等量0.9%氯化钠注射液灌胃，均连续4周。

1.7.1组织取材：末次灌胃24 h后，3%戊巴比妥钠(2 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠。无菌条件下打开膝关节腔，刀片矢状位切取股骨内侧髁及胫骨平台约3 mm厚关节软骨标本，于10%多聚甲醛中固定，随后进行后续实验。

1.7.2HE染色及Mankin评分：10%多聚甲醛固定软骨标本48 h，20%EDTA脱钙4周。常规石蜡包埋、切片。石蜡切片常规脱蜡至水，苏木素染色10 min，0.7%盐酸乙醇分化数秒，流水洗涤后，伊红液浸染3 min。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。切片于光学显微镜下进行观察。Mankin法[11]评估软骨组织病理学变化。

1.7.3甲苯胺蓝染色：10%多聚甲醛固定软骨标本48 h，20%EDTA脱钙4周。常规石蜡包埋、切片。石蜡切片常规脱蜡至水，软骨染色液浸染30 min。自来水洗2 min后，丙酮分化软骨细胞呈紫蓝色。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。切片于光学显微镜下进行观察。

2 结果

2.1Tan ⅡA对大鼠软骨细胞活力的影响 Tan ⅡA在6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L浓度下对大鼠软骨细胞活力无明显影响(P>0.05)，Tan ⅡA在100.00 μmol/L浓度下可抑制大鼠软骨细胞活力(P<0.05)，见表1。因此后续的细胞实验Tan ⅡA使用浓度为25.00 μmol/L和50.00 μmol/L。与对照组相比，IL-1β可显著降低软骨细胞活力(P<0.05)，与IL-1β组相比，Tan ⅡA(25.00 μmol/L和50.00 μmol/L)呈剂量依赖性升高软骨细胞活力(P<0.05)。见表2。

表1 丹参酮ⅡA对大鼠软骨细胞活力的影响

表2 丹参酮ⅡA对白细胞介素-1β诱导大鼠软骨细胞活力的影响

2.2Tan ⅡA对IL-1β诱导大鼠软骨细胞NO、PGE2、iNOS和COX-2表达的影响 与对照组相比，IL-1β显著升高大鼠软骨细胞中NO、PGE2、iNOS和COX-2的表达(P<0.05)；与IL-1β组相比，Tan ⅡA(25.00 μmol/L和50.00 μmol/L)呈剂量依赖性降低大鼠软骨细胞中NO、PGE2、iNOS和COX-2的表达(P<0.05)。见图1和表3。

表3 丹参酮ⅡA对IL-1β诱导大鼠软骨细胞NO、PGE2、iNOS和COX-2表达的影响

图1 丹参酮ⅡA对IL-1β诱导大鼠软骨细胞iNOS和COX-2蛋白表达的影响 iNOS为一氧化氮合酶，COX-2为环氧化酶-2；IL-1β组仅予白细胞介素-1β处理，C、D组分别予25.00、50.00 μmol/L丹参酮ⅡA处理

2.3Tan ⅡA对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞MMPs表达的影响 与对照组相比，IL-1β可显著升高大鼠软骨细胞中MMP1、MMP3和MMP13的表达(P<0.05)；与IL-1β组相比，Tan ⅡA(25.00 μmol/L和50.00 μmol/L)呈剂量依赖性降低大鼠软骨细胞中MMP1、MMP3和MMP13的表达(P<0.05)。见图2和表4。

表4 丹参酮ⅡA对白细胞介素-1β诱导的大鼠软骨细胞基质金属蛋白酶表达的影响

图2 丹参酮ⅡA对白细胞介素-1β诱导的大鼠软骨细胞基质金属蛋白酶表达的影响 对照组予白细胞介素-1β+磷酸缓冲盐溶液处理，IL-1β组仅予白细胞介素-1β处理，C、D组分别予25.00、50.00 μmol/L丹参酮ⅡA处理；MMP1为基质金属蛋白酶1，MMP3为基质金属蛋白酶3，MMP13为基质金属蛋白酶13

2.4Tan ⅡA对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan的影响 与对照组相比，IL-1β可显著降低Ⅱ型胶原和Aggrecan的表达(P<0.05)；与IL-1β组相比，Tan ⅡA(25.00 μmol/L和50.00 μmol/L)呈剂量依赖性升高Ⅱ型胶原和Aggrecan的表达(P<0.05)。见图3和表5。

表5 丹参酮ⅡA对白细胞介素-1β诱导的大鼠软骨细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan的影响

图3 丹参酮ⅡA对白细胞介素-1β诱导的大鼠软骨细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan的影响 对照组予白细胞介素-1β+磷酸缓冲盐溶液处理，IL-1β组仅予白细胞介素-1β处理，C、D组分别予25.00、50.00 μmol/L丹参酮ⅡA处理

2.5Tan ⅡA对对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞β-arrestin2和NF-κB通路的影响 与对照组相比，IL-1β可显著降低β-arrestin2的表达，升高p-p65/p65的表达(P<0.05)；与IL-1β组相比，Tan ⅡA(25.00 μmol/L和50.00 μmol/L)呈剂量依赖性升高β-arrestin2的表达和剂量依赖性降低p-p65/p65的表达(P<0.05)。见图4和表6。

表6 丹参酮ⅡA对白细胞介素-1β诱导大鼠软骨细胞β-arrestin2和NF-κB通路的影响

图4 丹参酮ⅡA对白细胞介素-1β诱导大鼠软骨细胞β-arrestin2和NF-κB通路的影响 对照组予白细胞介素-1β+磷酸缓冲盐溶液处理，IL-1β组仅予白细胞介素-1β处理，C、D组分别予25.00、50.00 μmol/L丹参酮ⅡA处理

2.6各组大鼠膝关节软骨组织病理学及相关指标变化 对照组大鼠软骨表面光滑，软骨细胞排列整齐，模型组大鼠软骨表面明显粗糙，软骨层变薄，软骨细胞排列紊乱，提示Tan ⅡA可明显改善OA大鼠软骨组织病理学变化。见图5、图6。与对照组相比，模型组大鼠Mankin评分显著升高(P<0.05)；与模型组相比，Tan ⅡA组大鼠Mankin评分显著降低(P<0.05)。见表7。

表7 各组大鼠关节损伤相关指标比较分)

图5 各组大鼠膝关节软骨组织HE染色所示(标尺=50 μm) Tan ⅡA组造模成功后予丹参酮ⅡA 0.5 mg/kg灌胃，模型组造模成功后和对照组(未造模)予等量0.9%氯化钠注射液灌胃

图6 各组大鼠膝关节软骨组织甲苯胺蓝染色所示(标尺=50 μm) Tan ⅡA组造模成功后予丹参酮ⅡA 0.5 mg/kg灌胃，模型组造模成功后和对照组(未造模)予等量0.9%氯化钠注射液灌胃

3 讨论

OA是最常见的退行性关节炎，以关节功能障碍和身体残疾为特征。OA的临床特征包括关节痛、关节僵硬和活动能力丧失。炎症反应和代谢紊乱对OA的发展至关重要[12]。尽管近年来，我们对OA的治疗取得了极大的进步，但自20世纪中叶以来，OA的患病率已翻了一番[13]。已有研究证明Tan ⅡA在其他疾病中具有抗炎作用[14]，然而Tan ⅡA在OA中的作用机制尚不明确。因此，本研究旨在探究Tan ⅡA对OA软骨细胞及软骨基质的作用，以期为OA的治疗提供新的科学资料。

在OA过程中，IL-1β刺激NO、iNOS、PGE2、TNF-α和COX-2等炎性介质的产生和分泌，导致软骨细胞功能障碍[3-4]。MMPs和ADAMTS-5是参与软骨降解的关键酶[15]。益母草能明显抑制IL-1β诱导的软骨细胞中炎性因子NO、PGE2和TNF-α的产生，降低iNOS、COX-2、MMP3、MMP13和ADAMTS-5的表达[16]。研究表明，Tan ⅡA通过促进谷胱甘肽二硫化物的分解，诱导谷胱甘肽的再生，参与线粒体凋亡途径在过氧化氢(H2O2)诱导的人脐静脉血管内皮细胞损伤中发挥保护作用，保护细胞免受H2O2引发的炎性介质的影响[17]。本研究结果显示，Tan ⅡA可抑制软骨细胞活力，抑制IL-1β诱导的软骨细胞中NO和PGE2的产生，抑制iNOS、COX-2、MMPs的表达，表明Tan ⅡA可抑制IL-1β诱导的软骨细胞炎症及软骨基质降解。软骨细胞外基质主要由纤维蛋白组成，包括胶原蛋白、蛋白多糖和透明质酸。关节软骨中90%的蛋白多糖是Aggrecan[18]。进一步研究结果显示，Tan ⅡA也可逆转IL-1β诱导的Ⅱ型胶原和Aggrecan的下调，表明Tan ⅡA可促进软骨细胞外基质生成，在IL-1β诱导的软骨细胞损伤中发挥保护作用。

ERK/NF-κB途径激活可导致COX-2和白细胞介素-8水平升高，从而导致关节软骨细胞的过度炎症反应[19]。IL-1β可诱导软骨细胞NF-κB通路的激活，大黄素可以抑制IL-1β诱导的NF-κB通路的激活，以改善OA软骨降解[20]。已有研究表明，Tan ⅡA通过抑制NF-κB通路的激活，抑制成骨细胞中H2O2水平、活性氧积累和细胞凋亡，在骨质疏松小鼠成骨分化过程中发挥保护作用[21]。β-arrestin2是NF-κB通路的上游细胞因子，敲低β-arrestin2可诱导NF-κB通路的激活，β-arrestin2过表达则可抑制NF-κB通路的激活[22]。证据显示，Tan ⅡA通过上调β-arrestin2的表达来抑制类风湿关节炎患者外周血单核细胞的炎症反应[23]。本研究结果显示，Tan ⅡA可促进IL-1β诱导的软骨细胞中β-arrestin2的表达，抑制NF-κB通路的激活。为进一步证实Tan ⅡA在OA中的作用，我们建立了OA大鼠模型，体内实验结果显示，Tan ⅡA可明显改善OA大鼠病情。

综上，Tan ⅡA通过调节β-arrestin2表达抑制软骨细胞炎症及软骨基质降解，明显改善OA大鼠病情。该结果为明确Tan ⅡA在OA中的作用机制及研发新的OA治疗药物提供了新的科学资料。