电离辐射损伤治疗相关细胞因子及递送方式的研究进展

田欣欣 武莉 张海玲 杨菁

中国医学科学院生物医学工程研究所，天津市生物医学材料重点实验室，天津300192

0 引 言

当前，核技术在军事、医学及核能源等方面的应用越来越广泛，但辐射暴露对人类健康也存在巨大威胁。当机体在短时间内受到大于1 Gy的电离辐射时，就会引发急性放射病，并出现感染、出血等一系列并发症，甚至导致死亡，因此将这些辐射引起的症候群统称为急性辐射综合征（acute radiation syndrome，ARS）。根据辐照剂量及临床特征，可将急性放射病分为骨髓型、肠型和脑型。骨髓型ARS即造血系统损伤，主要表现为全血细胞减少，其机制为细胞对辐射的敏感性与细胞的分化程度成反比，如造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）、肠干细胞（intestinal stem cell，ISC）等分化程度越低的细胞对辐射敏感性越高[1]。整个造血系统功能的正常发挥主要依赖于HSC，因此造血系统对电离辐射很敏感，在辐射剂量超过1 Gy时即可发生损伤。而全血细胞减少可诱发感染和出血等症状，是核暴露导致人类死亡的主要原因[2]。肠型ARS发生在辐照剂量较大时，主要表现为肠黏膜和血管的完整性快速丧失，这会导致肠道对营养物质和液体的吸收不良以及肠道屏障功能的丧失。肠型ARS患者在辐射暴露7～10 d后即出现脱水、败血症和出血等症状，若不进行治疗，最终将会导致死亡[3]。因此降低ARS死亡率的关键是维持造血系统的稳定和肠道组织的完整性。临床治疗除了抗感染、补液和营养支持等基础性治疗外，还包括辐射暴露后24 d内尽快使用促进造血和肠黏膜修复的细胞因子进行治疗。

在大多数辐射事故中，通常会保留部分骨髓细胞[4]。造血修复相关的细胞因子可刺激患者自身保留的骨髓HSC，诱导HSC向粒细胞、红细胞和血小板进行分化，维持血液系统的稳态，降低感染和出血的风险，从而减缓辐射损伤症状的发生并提高辐射暴露后的生存率。肠道修复相关细胞因子可刺激ISC的增殖分化和上皮细胞的迁移，快速恢复小肠组织的完整性，发挥营养吸收和屏障功能，避免感染和败血症的发生。

1 ARS治疗相关细胞因子

1.1 造血修复相关细胞因子

1.1.1 粒细胞集落刺激因子

粒细胞减少是辐射损伤诱导感染的主要因素之一。粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulatingfactor，G-CSF）可刺激自体保留的HSC向中性粒细胞分化，降低感染风险，对受到致死剂量辐射小鼠的造血和生存具有积极作用[5-6]，因此成为ARS治疗的金标准。G-CSF应在辐射暴露后24 h内尽快给药，且当中性粒细胞绝对值小于500个/μl时，更强烈推荐使用G-CSF。目前，G-CSF已被美国食品药品监督管理局确定为突发辐射公共卫生事件储备药物[7]。

1.1.2 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）可刺激HSC向粒细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）和单核细胞分化。因此GM-CSF比单纯刺激中性粒细胞的G-CSF具有更广泛的作用，临床上用于各种原因引起的白细胞或粒细胞减少症，同时被美国食品药品监督管理局批准用于ARS的治疗[7]。若不能在辐射暴露后24 h内及时给予G-CSF细胞因子治疗，在辐射暴露后48 h内给予GM-CSF进行干预，依旧有效[8-9]。

1.1.3 白细胞介素12

白细胞介素12（interleukin-12，IL-12）具有调节造血和免疫的作用[10-13]，可用于治疗ARS和放射治疗导致的造血系统损伤。IL-12对放射治疗后的外周血细胞下降、骨髓抑制、免疫功能异常等并发症具有治疗和保护作用[14]，但也有研究结果证明过量IL-12可诱导炎症发生[10]。在急性移植物抗宿主病患者体内发现IL-12高表达，对造血重建具有消极影响[15]。因此使用IL-12时应注意剂量问题。

1.1.4 血小板生长因子

血小板生长因子又称IL-11，是一种刺激巨核细胞生长及分化的内源性细胞因子，10年前被批准用于临床治疗慢性免疫性血小板减少症。血小板减少导致的出血是造血系统损伤的主要症状之一[16]。相关动物研究结果表明，当在致死性全身辐照后第1、3或5天使用Nplate（一种血小板生长因子模拟剂），被辐射小鼠的存活率可高达100%[17]。此外，Nplate与其他细胞因子如G-CSF进行联合治疗，可有效改善外周血细胞水平并提高小鼠存活率。Wong等[18]的研究结果证明在LD30/45的辐射剂量下单独使用Nplate或联合G-CSF均可改善血小板水平。有趣的是，除了改善血小板水平外，两者联用还能进一步改善中性粒细胞水平，这表明Nplate与G-CSF联用会产生协同效应。

1.2 肠黏膜修复相关细胞因子

1.2.1 表皮生长因子

表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）与受体结合可激活角质细胞和真皮成纤维细胞生成，从而促进皮肤伤口愈合，被用于各种创面的愈合及胃肠道溃疡的修复[19-22]。上皮细胞的再生对肠道损伤后的组织修复同样至关重要。辐射暴露后隐窝细胞密度与辐射剂量呈负相关，并决定肠道黏膜损伤能否恢复[3]。ISC生态位可提供EGF信号，用以维持隐窝柱状上皮的完整性[23]。因此EGF可有效促进辐射诱导的肠道损伤修复。

1.2.2 成纤维细胞生长因子2

成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）不仅可促进内皮细胞的迁移和平滑肌细胞的增殖，还可减少辐射暴露后小肠隐窝干细胞的凋亡。FGF2受体抑制剂可增加非小细胞肺癌对放射治疗的敏感性，也从侧面提示FGF2对被辐射细胞具有保护作用[24]。Kim等[25]证明FGF2处理可促进大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6的增殖，减少凋亡；辐射后给予FGF2可改善小肠上皮组织的不完整，增加隐窝干细胞的存活数量，提高大鼠的生存率；FGF2与骨髓移植联合治疗辐射肠道综合征可取得更好的治疗效果。但FGF2在辐射肠道综合征治疗中的作用机制还有待进一步研究。

2 细胞因子的递送

虽然细胞因子的治疗可改善造血和恢复肠道完整性，提高生存率，但细胞因子的应用仍存在问题，如细胞因子的功能较单一[26]，在体内易被酶降解、半衰期过短、需要一天多次或高剂量给药[27]，毒性较大等[28]。通过对细胞因子本身进行修饰或开发新型递送载体可能解决这些问题。

2.1 细胞因子的修饰

细胞因子的修饰主要是对其进行聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）化。PEG是一种无毒、水溶性的高分子聚合物，因其具有较大的流体动力学体积而在药物周围形成屏蔽，进而保护药物免受肾脏清除、酶促降解和免疫细胞识别。大量研究结果证明蛋白质的PEG化可有效延长蛋白质在体内的半衰期并降低蛋白质在体内的免疫原性[27]。动物实验结果显示，小鼠在全身辐照后24 h内皮下注射PEG-G-CSF，造血重建得到明显改善，血小板、红细胞和中性粒细胞恢复加速，且致死剂量照射后30 d的生存实验结果显示，PEG-G-CSF组小鼠比G-CSF组具有更高的生存率[29]。目前在国内外均已有PEG化的G-CSF药物上市，如Neulasta和津优力等。由于促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）的循环半衰期极短，在体内几乎无活性，PEG化后能明显延长EPO在体内的半衰期，发挥其促红细胞生成的功能[30]。重组人IL-11被批准用于临床治疗癌症患者放化疗后的血小板减少症，但其半衰期非常短，必须每天注射。PEG化的IL-11在灵长类动物药代动力学实验中的药时曲线下面积较IL-11增加了79倍以上，循环半衰期可长达67 h[31-32]。

2.2 细胞因子的递送系统

2.2.1 凝胶递送系统

凝胶递送系统因其良好的生物相容性、可注射性以及缓控释等特点，被广泛用于药物和细胞因子的递送。Song等[33]发现了一种在水溶液中自组装形成的可注射多孔PEG-b-聚（L-丙氨酸）水凝胶，在自组装过程中很容易将肿瘤细胞裂解物、GM-CSF和免疫检查点抑制剂（抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4/程序性死亡受体1抗体）共同包裹于水凝胶中，在体内持续释放，招募和激活树突状细胞，并诱导强烈的T细胞反应，进一步增强免疫检查点疗法。

水凝胶近年来还被用于与纳米粒子/胶束的联合递送。Rezaei等[34]将负载万古霉素的丝素蛋白-海藻酸钠纳米粒子包埋于含有EGF的聚（N-异丙基丙烯酰胺）水凝胶中，用于金黄色葡萄球菌感染的大鼠烧伤创面再生。通过该技术，超过80%的EGF生物活性被保存，聚（N-异丙基丙烯酰胺）水凝胶可支持成纤维细胞的增殖和生长，且EGF在水凝胶中20 d大约释放了30%。Sun等[35]设计了一种可注射的聚己内酯-PEG-聚己内酯热敏水凝胶共包埋鸡卵清蛋白纳米粒子和GM-CSF，将水凝胶作为载疫苗和缓释细胞因子的平台招募树突状细胞，提高树突状细胞的抗原摄取效率，产生强烈的T细胞反应。

糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）的聚合物网络可对细胞因子进行仿生管理，从而改变细胞功能，目前已成为一种功能多样性的水凝胶变体[36]。肝素GAG本身具有较高的负电性，为大量不同趋化因子和生长因子的非共价络合提供了可能。肝素结合EGF在水凝胶中与GAG结合可作为EGF的一个储存库，诱导EGF受体长期激活，促进伤口愈合[37]。对GAG水凝胶进行PEG修饰可调整物理特性、生物功能化和降解性以及编程宿主反应，且可在几天内快速融入组织。将PEG修饰的GAG水凝胶皮下植入C57BL/6小鼠长达28 d，仅引起轻微的异物反应[38]。

2.2.2 纳米粒子递送系统

纳米粒子递送系统具有提高生物利用度、靶向功能、降低药物毒性和缓控释等特点，被广泛用于药物递送。纳米粒子递送系统在生物大分子的递送方面也发挥着重要作用。Silva等[39]设计了一种壳聚糖修饰的透明质酸纳米粒子用于EPO的眼部给药，提高EPO在眼部生物利用度的同时提高其保留时间和透过不同眼膜的能力。Margulis等[40]利用白蛋白的脱溶和热变性能将水溶性荧光染料吲哚菁绿包裹在内形成纳米粒子，并在pH5.5时将G-CSF通过碳化二亚胺键连接到纳米粒子表面，形成稳定的纳米结构。研究结果证明该纳米粒子将G-CSF作为靶向配体，在体外和体内均实现了卓越的髓系选择性。

近些年细胞因子与小分子化学药物的联合递送得到了广泛研究。Hu等[41]先利用酸敏材料聚乙二醇单甲醚-Dlinkm-外消旋聚乳酸和泊洛沙姆F127负载紫杉醇制成纳米粒子，然后利用泊洛沙姆F127的低温膨胀作用使纳米粒子膨胀变得疏松，便于IL-12吸附进入纳米粒子的空隙中，实现疏水化学治疗药物紫杉醇和IL-12的共同递送。该纳米粒子可富集于肿瘤部位，激活T淋巴细胞和自然杀伤细胞释放干扰素γ，诱导肿瘤相关巨噬细胞M1型分化，从而改善肿瘤免疫抑制微环境，显著抑制乳腺癌细胞的增殖和转移。Bauleth-Ramos等[42]为了获得免疫治疗和化学治疗的联合作用，制备了精胺修饰的缩醛葡聚糖纳米粒子，负载化学治疗药物Nutlin-3a和GMCSF，并在结直肠癌多细胞瘤球状模型的二维培养和三维模型中进行测试，结果显示该纳米粒子可明显抑制瘤细胞的增殖。

2.2.3 微球递送系统

微球是指药物分散或被吸附于高分子、聚合物基质中而形成的微粒分散体系，被广泛用于延长药物的释放周期。DeJulius等[43]证明传统可降解聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]和活性氧响应型可降解聚硫丙烯的聚合物微粒子能有效包载EPO-R76E（一种EPO衍生物），并实现持续释放，小鼠眼部注射后28 d仍可检测到EPO-R76E。Liu等[44]先制备载有G-CSF、EPO和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的右旋糖酐纳米粒，再将所得纳米粒包裹于PLGA微球中获得蛋白-右旋糖酐-PLGA微球。GCSF、EPO和VEGF在体外释放可长达4周以上。将微球注射至缺血的大鼠后肢，VEGF、EPO和G-CSF联合治疗的促血管新生作用显著高于单细胞因子治疗。PLGA微粒虽可显著延长细胞因子的释放周期，但存在酸性降解产物和爆发性释放的问题。为此，Ge等[45]利用双乳液技术与微流控技术相结合的方法，成功制备了具有核壳结构的PLGA/壳聚糖-肝素复合微粒，该复合微粒的细胞毒性和突释（装载FGF2和VEGF）均得以显著降低。

2.2.4 脂质体递送系统

脂质双分子层包括亲水区和疏水区两部分，可进行不同性质药物的联合递送，且具有无毒、无免疫源性及制备条件温和等特点，被广泛用于生物大分子和脂溶性化学小分子药物的递送。Lu等[46]制备了含有视黄酸可变形脂质体和EGF阳离子可变形脂质体的药膏，用于治疗深层烧伤。这两种脂质体均具有药物包埋效率高、药物持续释放等特点。与游离药物相比，这两种脂质体的皮肤通透性更强，药物沉积分别增加2.9倍和18.8倍。制备的双脂质体软膏在深层烧伤模型中可促进皮肤附属物的形成并增加胶原蛋白的产生，协同促进伤口愈合。Le等[47]先制备含有马来酰亚胺基团的姜黄素脂质体（curcumin liposome，LP-Cur），然后将硫醇化的EGF通过马来酰亚胺基团结合到LP-Cur表面，得到EGF-LP-Cur脂质体囊泡。该脂质体囊泡可靶向EGF受体，从而增强姜黄素对人胰腺癌细胞的抗肿瘤活性。

3 展望

ARS属于全身性疾病，特别是暴露于高剂量辐射的情况下，同时伴有造血系统和肠黏膜的损伤。细胞因子用于ARS的治疗可促进造血系统和肠黏膜损伤的修复，进而改善生存率。研究结果发现在ARS的治疗中，多细胞因子的联合应用比单细胞因子具有更好的治疗效果，且通过对细胞因子进行PEG修饰或对其递送载体进行修饰不仅可显著延长细胞因子在体内的半衰期，还可实现细胞因子与药物的联合递送治疗。除了具有治疗作用的细胞因子和药物，功能性载体材料也可应用于ARS的治疗中。ARS的损伤机制主要是活性氧过量产生诱导了细胞凋亡，因此活性氧响应性材料可作为ARS治疗的载体。一方面，活性氧响应性载体材料可携带细胞因子用于ARS治疗，既可消除过量活性氧，减缓辐射损伤的进一步加深，又可发挥细胞因子对造血系统和肠黏膜损伤的修复作用。另一方面，造血相关细胞因子主要作用于骨髓HSC，因此可将造血相关细胞因子作为靶向分子，结合到活性氧响应性功能材料表面，靶向递送至骨髓HSC，达到协同治疗效果的同时降低药物毒性。此外，骨髓移植是重症ARS治疗的主要有效手段，但异体骨髓细胞移植存在免疫排斥和移植细胞存活时间短等问题，可利用功能性材料对移植细胞进行工程化修饰，降低细胞的免疫原性，提高细胞在体内的存活周期，进而提高骨髓移植的成功率。

志谢感谢天津市人才发展特殊支持计划高层次创新创业团队和天津市创新推进计划重点领域“免疫活性生物材料”创新团队

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