不同培养基上羊肚菌菌株产无性孢子观察

祁 鹏 张黎光 戴 璐 路鹏鹏 刘 愚 乔 婷 陈世明 李峻志*

（1陕西省微生物研究所，陕西西安 710043；2陕西宁陕县秦南菌业科技有限公司，陕西安康 711699）

羊肚菌隶属子囊菌门、盘菌纲、盘菌目、羊肚菌科，是一类世界性分布食药兼用的珍稀菌类[1-4]。文献记载，1990 年，VOLK、LEONARD[5]描述了羊肚菌无性孢子，并指出羊肚菌可能经历两种不同的生活史途径。2007 年，PILZ[6]报道并描绘了羊肚菌的无性孢子的形态，但缺乏更加详尽的影像资料。直到2010 年，MASAPHY 通过电子扫描显微镜观察并首次报道了红褐羊肚菌（Morchella rufobrunnea）的无性孢子[7]。但迄今为止，国内关于羊肚菌无性孢子的相关研究仍然较少。

笔者所在团队自1999年起开始研究羊肚菌，多年来积累了一定的羊肚菌种质资源和技术成果[8-12]。羊肚菌人工栽培及其他试验过程中均出现无性孢子的现象（即“菌霜”），但国内针对羊肚菌无性孢子的研究和微观描述目前较少，且是否所有羊肚菌均能够产生无性孢子尚不清楚。为此，笔者随机观察记录了5 株不同来源的羊肚菌菌株在3 种培养基上菌丝生长、产孢情况及孢子的微观特征，期望有助于我国羊肚菌的人工栽培技术研究和商业化开发。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

羊肚菌菌株随机选自陕西省微生物研究所秦岭菌物标本馆（SXIM），分离纯化后，编号M1、M2、M3、M4、M5保藏。

表1 供试羊肚菌菌株及来源

1.2 供试培养基

根据羊肚菌的生态特点，设计3种培养基，分别编号为①、②、③。①PDA 培养基。②木屑培养基：细木屑90%，麸皮9%，硫酸镁1%。培养料含水量55%～60%，pH 自然。拌料后装入培养皿中，厚度8～10 mm，121 ℃灭菌20 min。③腐殖土培养基：将腐殖土筛去石头和树枝后，按照1∶1 质量比加入细沙土，培养料含水量40%～50%，pH 自然。拌料后装入培养皿中，厚度8～10 mm，121 ℃灭菌120 min。

1.3 供试菌株的培养

将M1、M2、M3、M4、M5 菌株的纯培养物分别接种于PDA培养基平板上，置于培养箱中20 ℃恒温培养3～5 d，待菌丝即将长满平板时，取出备用。

1.4 供试羊肚菌菌株在3 种培养基上菌丝生长及无性孢子观察

用打孔器在M1、M2、M3、M4、M5 菌株的固体培养基平板上的菌落边缘区域，均匀打取直径6 mm的菌丝体块，分别接种于供试培养基①、②、③上，并在每个接种后的平板插入无菌的盖玻片，25 ℃恒温培养6～8 d 后[13]，采用奥林巴斯BX43 生物显微镜观察并记录。

2 结果与分析

2.1 供试羊肚菌菌株在3种培养基上菌丝生长状况

供试羊肚菌菌株在3种培养基上菌丝都能够很好的生长，但只有M2、M4菌株在培养基③上产生无性孢子。

表2 供试羊肚菌菌株在3种培养基上的菌丝生长状况

2.2 供试羊肚菌菌株在3 种培养基上产无性孢子观察结果

供试羊肚菌菌株在3 种培养基上培养6～8 d，在培养基③上，M2、M4 菌株率先产生无性产孢结构并产生无性孢子，其余菌株及培养基上，即使培养30 d仍未产生无性孢子。

由此可见，3 种培养基中，培养基①和培养基②不适合作为羊肚菌产孢的培养基，培养基③可作为羊肚菌产孢培养基。

就5 株供试羊肚菌菌株而言，M2、M4 菌株在培养基③上都产生了无性孢子，而在培养基①和②上均未产生无性孢子；M1、M3、M5 菌株在3 种培养基上均未产生无性孢子，因此推测这3 株羊肚菌繁殖不存在无性孢子阶段，与M2、M4菌株的生长发育阶段差异较大。

2.3 供试M2、M4菌株无性孢子的显微结构

在显微镜下观察M2 与M4 羊肚菌菌株无性产孢结构，未发现无性产孢结构存在明显差异。2 株羊肚菌菌株均在气生菌丝的顶端产生无性产孢结构，该结构均具备明显分化的孢子梗，一、二级分枝，分支末端即为小梗，小梗以轮状着生于分支菌丝上，每轮有3～6个小梗，在每个孢子梗的顶端以出芽方式产生1～2 个无性孢子。小梗长度为8～12 μm，无性孢子直径3～5 μm。无性孢子圆球形至椭圆球形，光滑，无色透明，单核，有油滴（图1）。

图1 M2、M4羊肚菌菌株无性孢子梗及无性孢子

3 小结与讨论

羊肚菌在石灰岩、白垩质土壤、腐殖土、黑黄色壤土、沙泥混合土、沙壤土中均能够生长。供试5株羊肚菌菌株在3种培养基上都能够很好地进行营养生长，也验证了羊肚菌菌丝具备较强生长能力，能够从多种不同的营养基质中获取营养，这可能是其在全世界范围内分布较广泛的重要原因。

供试菌株M2（尖顶羊肚菌）和M4（梯棱羊肚菌）在培养基③上产生了无性孢子，这一共同发育阶段，表明这两个种在进化过程中具备更近的亲缘关系，该特征或许可作为部分种属羊肚菌分类和鉴定的微观依据。供试粗腿羊肚菌菌株未见到无性孢子阶段，但不影响其在野外的正常生长和发育，可能其不存在无性孢子的生长发育阶段。目前对尖顶羊肚菌等无性孢子产生的作用、机理以及与羊肚菌子囊果发生的关系尚不明确。针对羊肚菌生活史和系统发育过程，笔者将会继续进行研究探索，并期望通过研究为羊肚菌人工驯化及稳产提供科学依据。