不同热处理脱脂乳粉对褐色乳酸菌饮料稳定性的影响

余志坚，张 敏，姚梦柯，赵 娟，陈 超，曹永强，杨贞耐,，*

(1.北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心/北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048；2.赣州市畜牧研究所，江西 赣州 341000；3.东君乳业(禹城)有限公司，山东 德州 253000)

褐色乳酸菌饮料是指以脱脂乳粉和葡萄糖为原料，经高温长时间美拉德反应褐变，冷却后接种乳酸菌，再发酵得到发酵乳，并以此为基料，加入水、甜味剂、酸味剂、稳定剂、香精调配而成的发酵型乳酸菌饮料[1]。在高温褐变阶段，美拉德反应赋予产品良好的风味和口感；在长时间发酵阶段，乳糖降解为乳酸，蛋白质降解为小肽段和氨基酸，有利于人体吸收。目前，褐色乳酸菌饮料根据其生产过程中发酵处理后是否经过杀菌可分为活菌型和杀菌型。活菌型产品需冷链运输保藏；而杀菌型产品中不存在活菌，可常温保存6个月以上，但是产品易出现分层、沉淀等不稳定现象[2]。脱脂乳粉是以新鲜牛乳为原料,离心脱脂后经杀菌、蒸发浓缩，喷雾干燥制成，其中蛋白质不低于非脂乳固体的34%，脂肪不高于2.0%[3]。脱脂乳粉根据其生产过程中脱脂乳热处理杀菌温度不同，通常可分为高温(80 ℃，30 min或120 ℃，1 min )、中温(75 ℃，1～3 min)和低温脱脂乳粉(75 ℃，15 s)。由于脱脂乳粉不同热处理生产时受热程度不同，乳酸菌饮料产品稳定性也不同。合适的热处理脱脂乳粉作为褐色乳酸菌饮料的原料，对产品稳定性具有重要影响。

本研究拟通过比较不同热处理(高温、中温、低温)脱脂乳粉的理化性质，包括溶解性、乳化性和乳化稳定性、起泡性和起泡稳定性、乳清蛋白氮指数及粒径的差异；并以鲜制脱脂乳作为对照，进一步比较以不同热处理脱脂乳粉为原料的杀菌型褐色乳酸菌饮料在生产过程中的粒径、电位、离心沉淀率及Lumisizer稳定性等。本研究通过确定生产褐色乳酸菌饮料的最佳热处理脱脂乳粉及影响饮料稳定性的关键工艺，以期为改进褐色乳酸菌饮料加工工艺并提高其储藏稳定性提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜牛乳，北京半截河奶牛场；低温脱脂乳粉，内蒙古兰多河乳品有限公司；中温脱脂乳粉，新西兰恒天然乳品有限公司；高温脱脂乳粉，北京万宝乳业有限公司；色拉油，金龙鱼食品有限公司；葡萄糖，山东西王糖业有限公司；白砂糖，太古糖业(中国)有限公司；干酪乳杆菌N115，北京工商大学乳品实验室保藏菌种；果胶，河南万邦实业有限公司；硫酸铜、硫酸钾、盐酸、硼酸、氢氧化钠、甲基红、亚甲基蓝、无水乙醇、异戊醇(均为分析纯)，上海麦克林生化科技有限公司；酚酞、邻苯二甲酸氢钾、十二烷基硫酸钠、氯化钠(均为分析纯)、质量分数98%浓硫酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

CP124S型分析天平，德国Startorius公司；CR21GⅢ型台式离心机、U-3900型紫外可见分光光度计，日本Hitachi公司；Kjeltec8100型全自动凯氏定氮仪，福斯分析仪器有限公司；R30型搅拌器，上海弗鲁克流体机械有限公司；HZQ-Q型振荡器，东联电子技术有限公司；HSW12型恒温水浴锅、THZ-D型电热恒温培养箱、DHG-9055A型鼓风干燥箱，上海一恒实验设备有限公司；D-3L型高压均质机，美国phd-tech公司；Nano 900型粒径电位仪，马尔文仪器有限公司；MLS-3750型高压蒸汽灭菌器，日本三洋公司；Lumisizer稳定性分析仪，德国LUM公司；BCN-1360B型超净工作台，北京东联哈尔仪器制造公司。

1.3 实验方法

1.3.1样品液的制备

不同脱脂乳粉按每100 mL去离子水中溶解12 g脱脂乳粉还原；新鲜牛乳在室温(25 ℃)下8 000 r/min脱脂，过滤后备用，4 ℃冷藏备用，使用前室温下平衡1 h。

1.3.2脱脂乳主要成分及乳酸度测定

参照GB 5009.3—2016，使用直接干燥法测定水分含量。参照GB 5009.5—2016，使用凯氏定氮法测定蛋白质含量。参照GB 5009.6—2016，使用盖勃法测定脂肪含量。参照GB 5009.239—2016，使用酚酞指示剂法测定复原乳乳酸度。

1.3.3脱脂乳乳化性及乳化稳定性的测定

取样品液30 mL，缓慢加入色拉油10 mL，边加边搅拌，使其充分混合，12 000 r/min剪切1 min，充分乳化后得到乳状液，吸取底部50 μL乳状液，迅速和5 mL质量浓度为0.1 g/mL的SDS混合均匀，于500 nm处测其吸光度，10 min后再测其吸光度。乳化性和乳化稳定性计算见式(1)、式(2)。

(1)

(2)

式(1)、式(2)中，EAI，乳化活力指数，指每克蛋白的乳化面积，m2/g；A500 nm，样品在500 nm下的吸光度；ρ，样品蛋白质量浓度，g/mL；L，比色杯直径，cm；N，稀释倍数；φ，油相所占体积分数，%；ES，乳化稳定性，%；A0，0 min吸光度；A10，10 min时吸光度。

1.3.4脱脂乳起泡性及起泡稳定性的测定

取100 mL样品液，10 000 r/min剪切1 min后，倒入250 mL的量筒中，泡沫体积即为起泡性(mL)，30 min后，残留泡沫体积为起泡稳定性(mL)。

1.3.5脱脂乳粉乳清蛋白氮指数的测定

称取10 g脂肪乳粉复原于100 mL去离子水中。加入8.0 g NaCl沉淀酪蛋白及变性乳清蛋白，加塞后35～40 ℃水浴30 min，前15 min不停摇动，使蛋白质充分析出，静置15 min，趁热过滤后，凯氏定氮法测定滤液中的未变性的乳清蛋白质氮含量(mg/g)，即WPN值。对WPN值进行修正得到乳清蛋白氮指数(WPNI)，计算见式(3)。

(3)

式(3)中，WPNI，乳清蛋白氮指数；w，样品的水分含量，%；WPN，凯氏定氮测定的样品未变性乳清蛋白氮含量。

1.3.6脱脂乳粉的粒径测定

用Nano 900型激光粒径分析仪测定脱脂乳粉粒径。测试参数：水的折光指数为1.33，蛋白质的折光指数为1.529，吸光度为0，测试温度为25 ℃恒温。样品用超纯水稀释100倍后，过膜使用。

1.3.7杀菌型褐色乳酸菌饮料生产工艺

杀菌型褐色乳酸菌饮料的生产工艺参考王光强等[4]的方法并有所改进(见图1)。葡萄糖90 ℃热水溶解，冷却至35 ℃备用；脱脂乳粉45 ℃水溶解，剪切乳化15 min，并与葡萄糖水混合后定容，静置水合30 min。以鲜乳制备的脱脂乳为原料时，将牛乳8 000 r/min，20 min离心2次，过滤除去脂肪后，与葡萄糖水混合后定容静置水合。将混合物进行均质处理(65 ℃，15 MPa)，然后杀菌(65 ℃，30 min)。95 ℃高温褐变至标准颜色，充分冷却至39 ℃，接种干酪乳杆菌N1115(109CFU/mL)，混合均匀后，于37 ℃恒温培养箱中培养72 h后剪切破乳，20 MPa冷均质后备用。添加葡萄糖、白砂糖、果胶等辅料，与发酵液混合，剪切后调酸定容。将料液热均质(65 ℃，25 MPa)，然后灌装。将灌装后的饮料85 ℃杀菌30 min，冷却后进库保藏。

图1 褐色乳酸菌饮料生产工艺Fig.1 Production process of brown Lactobacillus beverage

1.3.8杀菌型褐色乳酸菌饮料稳定性评价

斯托克斯定律[式(4)]描述了颗粒的沉降速度与颗粒和流体的半径及黏度的关系。

(4)

式(4)中，v，颗粒沉降速度，m/s；r，颗粒半径，m；ρs，颗粒密度，kg/m3；ρf，流体密度，kg/m3；g，重力加速度，取9.81 m/s2；η，流体黏度，Pa·s。

根据斯托克斯定律，影响颗粒沉降速度的因素是颗粒粒径、颗粒与流体的密度差、流体黏度。褐色乳酸菌饮料中颗粒的沉降接近于球形颗粒在层流区域的自由沉降过程，因此可以依据斯托克斯定律判定饮料的沉降过程，来评判饮料的稳定性。

1) 粒径测定：采用Nano 900型粒径电位分析仪测定粒径的分布情况。动态光散射原理表明，粒子颗粒越小，布朗运动越快，光强变化越快。测试的参数为水的折光指数1.33，蛋白质的折光指数1.529，吸光度0，测试温度25 ℃恒温。样品用超纯水稀释100倍后，过膜使用。

2) zeta电位测定：用Nano 900型激光粒径分析仪测定饮料体系中zeta电位。在外加电场时，带电粒子向着电荷相反的方向运动，运动速度与zeta电位直接相关。测试的参数为水的折光指数1.33，蛋白质的折光指数1.529，吸光度0，测试温度25 ℃恒温。样品用超纯水稀释100倍后，过膜使用。

3) 离心沉淀率测定：在离心管中加入10 mL左右的乳饮料，进行离心，离心条件为4 000 r/min，10 min，4 ℃，取出后弃去上层溶液，倒置静置10 min后，准确称取沉淀质量(g)。离心沉淀率(%)的计算见式(5)。

离心沉淀率=[m(离心后)-m(离心管)]/
[m(离心前)-m(离心管)]×100% 。

(5)

4) Lumisizer稳定性测定：将平衡后的样品加入Lumisizer专用样品池中，进行检测。检测条件为曲线个数255，4 000 r/min，时间间隔为30 s。检测完毕使用Lumisizer专用软件进行数据分析。

1.4 数据处理

所有实验均重复3次，结果表示为3次平行实验的平均值±标准差。采用Microsoft Excel 2016、Origin 2018等软件进行数据分析并绘图，IMB SPSS Statistics 25.0对数据进行显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同热处理脱脂乳粉的理化性质比较

2.1.1脱脂乳粉复原乳的主要成分及乳酸度分析

表1比较了不同热处理脱脂乳粉复原乳以及鲜制脱脂乳的水分、蛋白质、脂肪含量及乳酸度的测定结果。除鲜制脱脂乳的脂肪含量高于复原乳外，各样品的其他指标差异不显著，且均符合国家标准。蛋白质中含氮量约为总蛋白质含量的16%，测定出含氮量后换算得到蛋白质的含量，蛋白质热变性是对高级结构的破坏，并不改变其一级结构和含氮量，因此热处理并未对蛋白质含量造成显著影响。不同预热温度处理对脱脂乳粉产品的主要成分含量和乳酸度均无显著影响。

表1 不同热处理脱脂乳粉复原乳及鲜制脱脂乳的主要成分及乳酸度Tab.1 Main components and acidity of reconstituted milk prepared from skim milk powder with different heat treatments and freshly skim milk

2.1.2脱脂乳粉的溶解度分析

溶解度是指乳粉在水中溶解并形成均一溶液的能力。图2显示低温、中温、高温脱脂乳粉的溶解度分别为99.4、99.3、99.1 g/100 g，溶解度均较好且差异不显著(P>0.05)。

2.1.3脱脂乳粉复原乳的乳化性及乳化稳定性分析

*表示数据间差异不显著(P>0.05)。图2 不同热处理脱脂乳粉的溶解度Fig.2 Solubility of reconstituted milk prepared from skim milk powder with different heat treatments

蛋白质作为一种两亲物质，可以降低界面张力，将油相和水相结合形成乳状液。蛋白质吸附在乳化微粒表面形成乳化吸附层，使微粒带上电荷，形成电荷排斥作用[5]；另一方面，微粒之间互相接近时，乳化剂吸附层之间产生排斥力，防止油滴碰撞凝聚，维持乳化体系稳定[6]。蛋白质的乳化性与乳化稳定性随着热处理强度的增大而显著降低(P<0.05)，这可能与乳蛋白质受热变性有关，见图3。受热时天然蛋白高级结构解体，蛋白质开始凝聚，减少可以乳化和稳定乳化液的天然蛋白含量，降低了乳化吸附层蛋白质膜的黏度和硬度[7]；同时暴露出更多的内部疏水基团，蛋白质的亲水亲油平衡破坏，从而降低蛋白质的乳化性及乳化稳定性[8]。

2.1.4脱脂乳粉复原乳的起泡性及起泡稳定性分析

*与**表示数据间差异显著(P<0.05)；*、#表示数据间差异不显著(P>0.05)。图3 不同热处理脱脂乳粉复原乳及鲜制脱脂乳的乳化性及乳化稳定性Fig.3 Emulsification and emulsibility of reconstituted milk prepared from skim milk powder with different heat treatments and freshly skim milk

蛋白质能够在气- 液界面形成坚韧的薄膜使大量气体进入，并维持所形成气泡不破裂。随着原料受热程度的增大，起泡性与起泡稳定性均显著降低(P<0.05)，见图4。影响蛋白质起泡的因素有蛋白质分子扩散速率、界面张力大小和疏水基团的分布[9]。泡沫蛋白膜的机械强度取决于分布在界面上的蛋白质之间的各种作用力，包括经典相互作用、氢键、疏水相互作用以及分子间二硫键的聚合作用，当各种力达到平衡时，界面的蛋白膜会稳定而富有弹性[10]。受热时蛋白质的高级结构解体内部疏水基团暴露[11]，增加了蛋白质的疏水性使其发生聚集，降低蛋白质分子扩散成膜速率；同时二硫键发生不可逆变化，形成了包含高比例的所有乳清蛋白、κ-酪蛋白(к-CN)和一部分αs2-酪蛋白(αs2-CN)的二硫键结合聚集体[12]，导致蛋白膜表面作用力平衡被破坏，样品起泡性和起泡稳定性下降。Dissanayake等[13]将乳清蛋白喷雾干燥后，探究其溶解度、热稳定性、乳化和起泡性能，结果表明热处理使乳清蛋白热凝固时间延长，起泡性降低，这与本研究结果一致。

2.1.5脱脂乳粉的蛋白质变性程度分析

*、**、***表示数据间差异显著(P<0.05)；#、##、###表示数据间差异显著(P<0.05)。图4 不同热处理脱脂乳粉复原乳及鲜制脱脂乳的起泡性及起泡稳定性Fig.4 Foaming property and foamability of reconstituted milk prepared from skim milk powder with different heat treatments and freshly skim milk

原料乳中的乳清蛋白热敏性高，而酪蛋白对热较稳定，通过除去酪蛋白和部分变性乳清蛋白，剩余的蛋白含量可以用来表示原料乳的受热变性情况。WPNI是指每克脱脂乳粉中未变性乳清蛋白氮的毫克数。WPNI值越高，蛋白变性程度越低[14]，见图5。

*、**、***表示数据间差异显著(P<0.05)。图5 不同热处理脱脂乳粉的乳清蛋白氮指数Fig.5 WPNI values of skim milk powder samples with different heat treatments

从图5可以看出，原料受热程度增加,乳清蛋白的变性程度显著增加(P<0.05)。热处理乳粉中未变性的乳清蛋白主要是α-La、β-Lg和BSA。热处理会破坏乳清蛋白的二级结构，使蛋白质分子伸展变性[15]。在低于100 ℃的条件下加热脱脂乳，若加热时间过长，同样可破坏大部分的乳清蛋白，造成乳清蛋白损失，一定程度上降低牛乳风味[16]。

进一步测定不同脱脂乳粉复原乳样品的粒径，见图6。由图6可知，中、高温脱脂乳粉复原乳的粒径显著大于鲜制脱脂乳和低温脱脂乳粉复原乳的粒径(P<0.05)。酪蛋白是由β-CN、αs1-CN、αs2-CN、κ-CN 4种单体组装的复合物[17]。热处理使蛋白质的高级结构受到破坏，β-CN、αs1-CN、αs2-CN从胶束上解离，胶束表面的κ-CN与β-Lg 以巯基-二硫键的方式进行交换，进而附着于胶束表面，聚合成络合物，疏水作用增强会进一步促进κ-CN与β-Lg的结合，粒径会逐步增大[18]。同时蛋白质电荷发生变化，蛋白质趋于聚集，也导致大分子物质的形成[19]。Corredig等[20]发现，随着温度不断升高，酪蛋白颗粒表面粘附的小颗粒逐渐增多，颗粒直径逐渐增大，这与本研究结果相似。

2.2 不同热处理脱脂乳粉对杀菌型褐色乳酸菌饮料稳定性的影响

2.2.1饮料生产过程中的粒径变化

*与**表示数据间差异显著(P<0.05)；*表示数据间差异不显著(P>0.05)。图6 不同热处理脱脂乳粉复原乳及鲜制脱脂乳的粒径Fig.6 Particle sizes of reconstituted milk prepared from skim milk powder with different heat treatments and freshly skim milk

依据斯托克斯定律，颗粒半径越大，颗粒的沉降速度就越快，体系越容易出现水析分层的沉淀，样品稳定性越差[21]。各组样品在饮料生产过程中粒径变化趋势一致，即在95 ℃高温褐变及发酵后体系微粒粒径显著增大，均质处理使粒径大幅下降，见图7。美拉德反应可能给体系带来更加复杂的化学组成，除了蛋白糖基化反应，还有其他非蛋白的聚合反应使蛋白质颗粒体积变大，产品稳定性下降[22-23]。使用中温脱脂乳粉为原料的产品粒径最小，可能是由于中温乳粉蛋白质变性程度适中，高级结构适当展开，链节变得更加柔软，暴露出适量的疏水基团，改善蛋白质的双亲性，使蛋白质分子有序排列，更易吸附于界面上。因此，物料的受热程度、加工过程的均质处理和配料定容是影响饮料稳定性的重要因素。

图7 不同热处理脱脂乳粉对饮料生产过程中粒径的影响Fig.7 Effects of skim milk powder with different heat treatments on particle size during process of beverage production

2.2.2饮料生产过程中的zeta电位变化

zeta电位绝对值反映胶体粒子表面带电荷情况，zeta电位的绝对值越高，颗粒间电荷排斥作用增强，体系稳定性越好。在饮料的生产过程中，中温乳粉为原料的产品电位绝对值最大，见图8。表明适当的热处理使乳清蛋白变性，蛋白质基团暴露，体系内电荷增多，有利于体系的稳定；但热处理程度进一步加大时，蛋白质变性严重，体系失稳[24]。高温褐变后体系电位绝对值明显下降，加入果胶配料后体系电位绝对值显著增加，表明高温褐变及加入果胶配料是影响饮料稳定性的重要工艺。酸性条件下，果胶上的—COOH负电荷和酪蛋白上的—NH2负电荷之间具有稳定的静电相互作用[25]，使酪蛋白微粒被带负电荷的果胶分子包围而带上大量负电荷[26]。

图8 不同热处理脱脂乳粉对饮料生产过程中zeta电位的影响Fig.8 Effect of skimmed milk powder with different heat treatments on zeta potential during process of beverage production

2.2.3饮料生产过程中的离心沉淀率变化

酸性乳饮料中，蛋白质会出现不同程度的聚集或沉降作用，致使体系失稳而形成沉淀。通过测定离心沉淀率可以表征样品中的粒子分布情况，进而反映样品的稳定性[27]。饮料生产过程中的离心沉淀率变化见图9。由图9可知，高温褐变显著提高了离心沉淀率；发酵液经均质后，体系中游离的H+与酪蛋白表面负电荷发生中和，减弱了蛋白质胶体之间的静电排斥作用，蛋白质开始聚集而沉淀[28]。因此，发酵均质后离心沉淀率仍然较高。配料后，由于水的稀释作用及加入果胶产生的保护层，离心沉淀率显著下降。中温脱脂乳粉为原料的产品离心沉淀率低于其他3组，表明以中温脱脂乳粉生产的饮料稳定性最佳；而使用鲜制脱脂乳的产品的稳定性最差。

图9 不同热处理脱脂乳粉对饮料生产过程中离心沉淀率的影响Fig.9 Effect of skimmed milk powder with different heat treatments on centrifugal precipitation rate during process of beverage production

2.2.4饮料生产过程中的Lumisizer稳定性变化

采用Lumisizer稳定性分析方法可以通过对样品中相界面的追踪，计算出样品体系中粒子的移动速度，测得每个样品不稳定指数，以此来比较所测样品体系稳定性的差异，不稳定指数越大说明体系越不稳定，见图10。由图10可知，在高温褐变处理后，物料的不稳定指数大幅度上升，发酵均质及配料定容后明显下降；以中温脱脂乳粉为原料的产品体系不稳定指数值在整个生产过程中处于最低水平，稳定性最佳。高温长时间热处理使蛋白质变性，发生聚集和交联，使蛋白质颗粒体积变大，产品稳定性下降；同时，长时间热处理脱脂乳粉会加重美拉德反应[29]，而过度美拉德反应会促进非蛋白聚合反应，从而导致沉淀的发生而降低体系稳定性。各样品稳定性由大到小依次为中温乳粉、高温乳粉、低温乳粉、鲜制脱脂乳，与基于粒径、zeta电位和离心沉淀率的体系稳定性结果一致。

图10 不同热处理脱脂乳粉对饮料生产过程中不稳定指数的影响Fig.10 Effect of skim milk powder with different heat treatments on instability index during process of beverage production

3 结 论

对不同热处理(低温、中温、高温)脱脂乳粉的理化性质研究表明：各乳粉样品的水分、蛋白质和脂肪含量，以及乳酸度无显著差异；随着脱脂乳粉受热程度的增大，其乳化性及乳化稳定性、起泡性及起泡稳定性显著降低(P<0.05)，而其溶解性均超过99%，差异不显著；且随着受热程度的增大，乳清蛋白氮指数随原料受热程度增加而减小，样品粒径从160 nm增大到426 nm。在饮料生产过程中，高温褐变使产品稳定性下降，均质处理及配料定容使体系更稳定。因此，高温褐变、均质处理和配料环节是影响褐色乳酸菌饮料稳定性的关键工艺。以不同热处理脱脂乳为原料的产品在生产过程中的稳定性由大到小依次为中温乳粉、高温乳粉、低温乳粉、鲜制脱脂乳。因此，选择中温脱脂乳粉作为褐色乳酸菌饮料生产原料。本研究以期为褐色乳酸菌饮料生产中选择适宜热处理的脱脂乳粉，优化配料及相关工艺参数，提高产品的稳定性提供一定的理论支撑。