基于网络药理学探讨温胆汤治疗高血压的作用机制

●李人亮 胡子毅 张 平

高血压是一种以体循环动脉压力升高为主要特征的心血管综合征，是临床常见的慢性疾病，是心脑血管疾病最常见但可逆的危险因素之一。大多数高血压患者没有明显的症状，少数可出现头晕、头痛和其它轻微症状，正是由于高血压病缺乏典型的症状，使得其在人群中具有潜伏性，难以及时发现[1]。长期的高血压可致使动脉粥样硬化，而动脉粥样硬化也会促使血压进一步升高，两者互相关联、相互促进，最终导致心、脑、肾等重要靶器官功能障碍，其常见的合并症有冠心病、脑卒中、急性主动脉综合征、外周动脉疾病[2]。根据2010年全球疾病负担研究，中国每年由于血压升高而导致的过早死亡人数高达200万，每年直接医疗费用达366亿元人民币[3]。根据2010年第六次全国人口普查数据测算，我国高血压患病人数约为2.45亿[4]。高血压对我国造成了巨大的社会经济压力和公共卫生负担，因此积极防治高血压具有重大意义。随着现代医学的飞速发展，尽管在血压的控制方面取得了显著的进步，但在缓解症状、改善血管内皮功能、保护靶器官等方面，中医药治疗更具优势。

高血压病在中医学理论中归属于“眩晕”“头痛”等范畴，本病以阴虚为本，阳亢为标，瘀血贯穿疾病始终，其中火、饮、虚是病机关键，三者往往合并存在，交互为病[5]。肝阳上亢，肝火上炎，阳升风动，上冲脑窍；脾胃虚弱，痰饮内生，肝风、肝阳夹痰浊之邪上冲清窍；大病久病及肾，肾阴亏虚，水不涵木，脑窍失养。武玉琳等人[6]对2001年至2017年已发表的关于中医药治疗原发性高血压的文献进行收集整理，筛选出有效处方1042个，通过复杂网络分析，得出了6个最为常见的中医证型，即肝阳上亢证、阴虚阳亢证、痰湿壅盛证、肝肾阴虚证、阴阳两虚证、肝火亢盛证。近年来的研究显示痰湿证候在高血压病中颇为常见[7]。温胆汤出自《三因极一病证方论·惊悸证治》，其组成包括半夏、陈皮、竹茹、枳实、茯苓、甘草六味药物，具有理气化痰，利胆和胃之功，临床常应用于治疗痰湿壅盛、痰浊中阻型高血压。有研究表明[8]，温胆汤对心脏间质成纤维细胞的过度增殖有一定的抑制作用，对高血压的心肌纤维化有预防与逆转作用，但具体机制尚不清楚，因此本研究运用网络药理学方法，探寻温胆汤治疗高血压的关键活性成分和主要靶点通路。

1 材料与方法

1.1 温胆汤活性成分的获取及靶点的筛选利用中药系统药理学分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），以陈皮、半夏、茯苓、甘草、枳实、竹茹为关键词，对温胆汤中6味中药的全部化学成分进行收集。若在TCMSP 数据库中无法获取数据，则通过TCMID 数据库（http：//bidd.nus.edu.sg/group/TCMsite/Default.aspx）和化学专业数据库（Chemsitry Database，http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp），以及检索国内外相关文献获取相关信息。通过限制口服吸收利用度(OB)≥30%、药物相似性(DL）≥0.18对温胆汤的活性成分筛选[9]。然后将筛选好的候选活性成分在TCMSP 数据库和SwissTarget Prediction 数据库（http：//swisstargetprediction.ch/）中收集蛋白靶点。最后通过Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）进一步将收集到的蛋白靶点转化为对应的基因名称，获取与活性成分作用的相关蛋白靶点（人源）。

1.2 高血压靶点筛选在疾病基因数据库（Genecard数据库，https：//www.genecards.org/；OMIM数据库，https：//omim.org/；Drugbank 数据库，https：//www.drugbank.ca/）中 以“hypertension”“hypertensive”“essential hypertension”为关键词进行检索，收集高血压疾病的相关基因。

1.3 网络构建与分析将获取到的温胆汤活性成分的预测靶点与高血压疾病相关靶点取交集，药物-疾病的交集基因。利用Cytoscape 3.6.0软件构建温胆汤的“成分-靶点”网络图，探究温胆汤活性成分和相关靶点的相互作用。然后在Tools 工具栏中的NetworkAnalyzer 模块中选择Analyze Network 功能对药物进行拓扑分析。在String 数据库（http：//stringdb.org/），通过交集得到的靶点构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。物种设为“Homo sapiens”(人类)，最低相互作用阀值设为最高置信度0.9“highest confidence”，其余参数保持默认设置。然后借助Cytoscape 3.6.0软件中CytoHubba 插件，依据MCC 得分进行核心（Hub）基因的筛选，选出得分排名前10位的基因。

1.4 基因本体论（GO）分类富集分析及京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析利用R软件中的BiocManager 软件包对上述交集基因进行GO和KEGG通路富集分析。

1.5 温胆汤治疗高血压的成分及机制的文献验证通过检索国内外文献，分析温胆汤治疗高血压的相关成分与机制，为网络药理学所预测的结果提供文献验证。

2 结果

2.1 活性成分筛选及靶点筛选本研究中半夏、陈皮、茯苓、甘草、枳实五味药物的化学成分通过TCMSP 数据库获得，竹茹化合物的基本信息通过化学专业数据库获得，通过限定OB≥30%和DL≥0.18进行筛选，剔除未找到靶点的化学成分，共得到236个活性成分，预测靶标2179个，见表1。将预测靶标去除重复值后，得到312个靶点。表2中列举出了温胆汤中靶点数排前10位的成分信息。

表1 温胆汤“中药-活性成分-预测靶标”信息

表2 温胆汤靶点数前10位成分信息

2.2 疾病靶点筛选结果通过Genecard数据库检索出高血压疾病相关基因735个，OMIM 数据库中获得97个基因，Drugbank数据库中获得16个基因，去除重复基因后，最后获得816个高血压疾病基因。

2.3 网络构建与结果分析将所得到的温胆汤的药物靶点与高血压相关靶点进行映射，得到94个共有靶点，对应温胆汤活性成分142个。利用Cytoscape软件构建药物-靶点网络，见图1。对药物-靶点网络的拓扑属性进行分析，先筛选出度值（Degree）与介数（Betweenness）均大于平均值的化合物，然后依照度值大小排序筛选出前10的化合物，见表3。利用String数据库将映射所得的94个靶点制作成PPI 网络，限定其置信度为0.9，其产生相互作用的网络有94个节点，229条边，平均节点度：4.87，平均局部聚类系数：0.474，见图2。利用Cytoscape 软件进行Hub 基因的筛选，根据MCC算法筛选出10个得分最高的基因，即STAT3、JUN、IL6、MAPK3、VEGFA、IL1B、AKT1、TIMP1、IL4、IL2，说明这10个基因是温胆汤治疗高血压的关键靶标，见图3。

图1 药物-疾病交集靶点网络

2.4 基因本体论（GO）分类富集分析及京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析利用R 软件的BiocManager 软件包对温胆汤治疗高血压的交集基因进行GO分类富集和KEGG 通路富集分析。依据P＜0.05进行GO 和KEGG 通路富集分析，其中富集靶标越多、P值越小的通路，与温胆汤治疗高血压的关系越为密切，分别筛选出前10条GO 条目和前20条KEGG 通路。GO 分类富集分析包括细胞组分（cellular component，CC）、生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）3个部分。通过GO分类富集分析确定了1837个条目，其中涉及生物过程的有1686条，涉及细胞组成的有61条，涉及分子功能的有90条，见图4。通过KEGG 通路富集分析，找到了126条信号通路，主要包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、流体剪应力与动脉粥样硬化通路、TNF信号通路、松弛素信号通路、HIF-1信号通路、IL-17信号通路等，见图5。

表3 度值前十的化合物

图2 温胆汤治疗高血压疾病PPI网络

图3 温胆汤治疗高血压疾病的Hub基因

图4 GO富集分析

图5 KEGG通路富集分析

2.5 文献验证温胆汤的临床应用范围较为广泛，主要用于治疗“痰”“气”(郁)“热”(火)为病机的多种疾病，包括精神神经系统、循环系统、呼吸系统、消化系统等方面疾病。方中以法半夏燥湿化痰为主药；痰因气滞，陈皮利气祛痰；茯苓健脾渗湿，使湿去而痰消；炙甘草补土和中；竹茹清脾胃郁热，枳实破滞助法半夏消痰；全方具有清痰利气调达气机之功。研究表明，槲皮素具有降压、降低血中低密度脂蛋白浓度的作用[10-11]；柚皮素具有抗动脉粥样硬化的作用[12]；川皮苷对NO 有双向调节作用，对血管内皮细胞具有一定的保护作用[13]。温胆汤可以减轻内皮细胞中由同型半胱氨酸引起的氧化应激反应，通过下调TNF-α/p38、MAPK／NF-κB 信号传导，缓解内皮细胞炎症损伤，进而对内皮产生一定的保护作用，最终达到降血压、抗动脉粥样硬化、抗血栓等作用[14]。

3 讨论

中药现代化、科学化的难点和问题关键在于中药复方成分较为复杂，多成分间存在协同作用，存在着复杂化学体系的物质基础和作用机理[15]。而网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统的网络分析，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科。中药网络药理学的主要目的是寻找适合中医药体系研究的模式和方法。中药网络药理学通过构建“成分-靶点-疾病”复杂网络，从整体和系统出发，阐释和分析研究对象的药理学机制，与中药多成分-多靶点的作用模式不谋而合，为研究中药成分复杂作用机制提供新的思路[16]。

本研究筛选出温胆汤与高血压疾病的交集基因94个，构建出药物-靶点网络，进一步进行拓扑分析，找出槲皮素、柚皮素、川皮苷、山奈酚、木犀草素等10种温胆汤治疗高血压的关键活性成分。槲皮素、柚皮素、川皮苷、山奈酚、木犀草素、刺芒柄花素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮均属于黄酮类化合物，具有抗炎，降压，降低血管的脆性，改善血管的通透性，降低血脂和胆固醇，扩张血管，抗血凝等作用[13]。结合文献验证，说明温胆汤治疗高血压的分子机制具有科学性。

同时将94个交集基因构建成PPI 网络，再根据MCC算法筛选出得分排前10的温胆汤治疗高血压的关键靶标，即STAT3、JUN、IL6、MAPK3、VEGFA、IL1B、AKT1、TIMP1、IL4、IL2。其中STAT3信号通路可释放白细胞介素（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF）等炎症因子，从而损伤心肌微血管内皮细胞[17]。JUN 是激活蛋白-1（AP-1）家族中生物活性最强的一员，AP-1是高血压心室肥厚发展过程中的重要转录因子，调控心钠肽（ANP）、脑钠肽（BNP）等心肌肥厚早期应答基因[18]。IL6、IL4、IL2、IL1B均属于白细胞介素（IL）家族成员，它们与高血压的发生发展过程密切相关[19]。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者。ERK1（MAPK3）是在哺乳动物中发现的第一个丝裂原活化蛋白激酶，ERK1通路的激活具有一定的抗氧化、抗炎，保护心肌细胞等作用[20]。血管内皮生长因子A(VEGFA)普遍存在于各组织器官中，主要生理功能是促进血管新生，在高血压导致的血管重建中具有调控作用[21]。AKT 是一种丝氨酸／苏氨酸激酶，在心肌肥厚和重塑中起着重要作用，在高血压心肌纤维化中，AKT1的表达及激活介导了炎症细胞作用下的成纤维细胞转分化[22]。

本研究通过KEGG 通路富集分析，找到了126条信号通路，主要包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪应力与动脉粥样硬化通路、TNF 信号通路、松弛素信号通路等通路。表明上述信号通路在温胆汤治疗高血压疾病中发挥重要的作用，值得进一步研究。晚期糖基化终产物（AGEs）是通过蛋白质、脂类和核酸的非酶糖基化和氧化而产生的，通过蛋白质交联或与细胞表面受体结合从而促进心脏功能障碍的发生[23-24]。有研究显示[25]，糖尿病患者体内产生的AGEs 通过激活AGE-RAGE信号通路，然后激活FSTL1的表达，从而促使IL-1β、TNF-α等炎性因子的表达，进一步导致动脉粥样硬化的发生。流体剪切应力和动脉粥样硬化通路是导致动脉粥样硬化的重要机制。TNF信号通路与炎症反应有关，参与动脉粥样硬化的发展过程[26]。

本研究利用网络药理学方法对温胆汤治疗高血压进行了分析，初步揭示了温胆汤治疗高血压的潜在活性成分、作用网络和潜在作用机制，为进一步探讨其发挥作用的药效物质基础和作用机制研究提供方向，其后续尚需系统的靶点验证和体内外实验证实其功效网络的内在关联和作用靶点集合。