消毒剂胁迫鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028s的抗性及耐药性测定

吴上,杨阳,孙嘉笛,杨嘉,张银志,孙秀兰*,纪剑*

消毒剂胁迫鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028s的抗性及耐药性测定

吴上1,杨阳1,孙嘉笛1,杨嘉2,张银志1,孙秀兰1*,纪剑1*

1. 江南大学 食品学院, 江苏 无锡 214122 2. 扬州市食品药品检验检测中心, 江苏 扬州 225000

为探索消毒剂胁迫后的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028s的抗性及对抗生素的耐药性，本研究选取次氯酸钠、氯已定（97%）、苯扎氯铵（80%）和十六烷基氯化吡啶（≥98%）分别胁迫鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028s，胁迫后菌株经消毒剂抗性测定及抗生素耐药性测定。结果表明，胁迫后的沙门氏菌，对4种消毒剂的抗性几乎不变，而对部分抗生素的抗性产生显著变化，其中经氯已定、次氯酸钠胁迫的菌株对环丙沙星和氨苄西林的耐药性显著增强，对庆大霉素的耐药性减弱；苯扎氯铵、十六烷基氯化吡啶胁迫的菌株对环丙沙星、四环素和庆大霉素的耐药性提升。因此，消毒剂的过度使用，对食品加工中耐药菌的防控具有理论意义。

沙门氏菌; 消毒剂; 抗性; 耐药性

在过去的几十年中，抗生素的治疗性误用和过度使用导致细菌对抗生素的耐药性急剧增加[1]。感染耐药沙门氏菌导致发病率和死亡率增加[2]。预防和控制家畜感染沙门氏菌依赖于在饲料中添加抗生素。然而，在不同的国家已经报道了许多抗抗生素的细菌[3-5]。大多数耐药沙门氏菌是人畜共患病的，沙门氏菌在畜禽动物宿主中获得耐药性，并可能通过食物链引起人类感染。根据疾病控制和预防中心（CDC）公布的数据，在美国，每年约有6200例感染耐药性沙门氏菌（占沙门氏菌感染总数的10%）[2]。鼠伤寒沙门氏菌血清型是产生抗生素耐药性的主要血清型之一，也是引起多重耐药性的沙门氏菌感染的主要菌株之一[6]。鼠伤寒沙门氏菌耐药性的增加导致抗生素的疗效下降是构成治疗失败的主要原因，对公众健康构成严重威胁[7]。

消毒剂广泛用于控制食品生产设施和环境中的微生物污染[8]。在目前可用的各种消毒剂中，含氯消毒剂（Chlorine-Containing Disinfectant）如次氯酸钠（Sodium Hypochlorite，SH）和氯已定（Chlorhexidine，CH）；季铵化合物（Quaternary Ammonium Compounds，QACs）如苯扎氯铵（Benzalkonium Chloride，BC）和十六烷基氯化吡啶（CetylpyridiniumChloride，CTPC）被广泛使用，因为这些化合物无刺激性和腐蚀性，毒性小，抗菌效率高[9]。在食品环境中广泛使用和滥用QACs消毒剂可对细菌施加选择性压力，并有助于抗消毒剂微生物的出现。

消毒剂抗性基因通常位于移动遗传元件中[10,11]。消毒剂的广泛使用引起了人们对其可能参与抗菌素耐药性的发展，特别是对抗生素的共同耐药性的关注[10,12]。因此，在同时使用抗生素和消毒剂的压力下，抗性基因的潜在共选择和获得性抗性的传播得以增强[13,14]。然而，关于消毒剂环境胁迫下沙门氏菌对消毒剂和抗生素的抗性变化规律知之甚少。本实验测定了鼠伤寒沙门氏菌标准菌株ATCC 14028s对消毒剂MIC值，并制备了消毒剂胁迫菌株，随后对胁迫后菌株的消毒剂及抗生素抗性进行检测，探讨了两种抗性之间的关系，推测了耐药变化的原因。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源14028s菌株由华中农业大学（中国湖北）提供。该菌株在-80 ℃下储存在20％甘油中。通过将100 μL转移至5 mL营养肉汤（NB）中，然后在37 °C下孵育24 h来制备培养物。

1.1.2 主要仪器与试剂 THZ-D台式恒温振荡器（太仓市强乐实验设备有限公司），WGZ-XT细菌浊度仪（杭州齐威仪器有限公司），KJ-201C微量振荡仪（江苏康健医疗用品有限公司）。选用4种常见消毒剂次氯酸钠、氯已定（97%）、苯扎氯铵（80%）和十六烷基氯化吡啶（≥98%）（阿拉丁试剂上海有限公司）进行消毒剂抗性测定及胁迫菌株制备。鼠伤寒沙门氏菌标准菌株ATCC14028s受到14种抗生素的挑战，14种抗生素包括：抑制细胞壁合成的药物包括氨苄西林（98%）、美罗培南（≥98%）、头孢他啶（97%）、头孢噻肟（≥98%）和粘菌素（98%）（中国麦克林生化有限公司）；抑制蛋白质合成的药物包括阿奇霉素98%、链霉素99%、丁胺卡那霉素98%、替加环素98%（中国麦克林生化有限公司）、四环素98%和氯霉素98%（中国子起生物有限公司）；抑制核酸合成的药物包括甲氧苄啶99.13%（中国子起生物有限公司）、萘啶酸98%（中国阿拉丁公司）、磺胺甲恶唑和环丙沙星≥99%（中国麦克林生化有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 ATCC 14028s对四种消毒剂的抗性测定采用二倍稀释法用已灭菌的无菌水稀释消毒剂，首先配置10240 μg/mL的最高浓度消毒剂，随后从最高浓度消毒剂中吸取1 mL消毒剂溶液到9 mL无菌水中，将稀释液加入96孔板第一孔中，梯度稀释使其浓度从1024、512、256 μg/mL依次递减到0.125 μg/mL，每个梯度3个重复。过夜培养的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028s新鲜菌液经过校准的浊度仪调整菌液浊度至0.5麦氏单位浊度，取上述菌悬液50 μL至含有10 mL MH培养基的无菌加样槽中，充分混匀后按照100 μL/孔加至含梯度稀释消毒剂的96孔板中，每个孔中液体的最终体积为200 μL。置于恒温恒湿培养箱内37℃孵育18~22 h，肉眼观察读取结果，结果解释参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）药敏试验解释标准，以大肠杆菌（ATCC 25922）菌株为质控菌株。

1.2.2 消毒剂胁迫后ATCC 14028s菌株的制备 参考沙门氏菌对四种消毒剂的最小抑制浓度（MIC）测定结果，将200 μL过夜培养的鼠伤寒沙门氏菌悬浮液分别加入到含有0.5MIC浓度的氯已定（CH）、次氯酸钠（SH）、苯扎氯铵（BC）、氯化十六烷基吡啶（CTPC）的20 mL培养基，在37 ℃、200 rpm的条件下培养8 h，制得四种消毒剂的应激培养物。对培养物进行稀释，以在抗生素激发的反应混合物中产生约6 log10 CFU/mL的最终浓度，每个消毒剂胁迫培养物设置三组生物学平行。（接种环浸泡在应激培养物中，然后通过划线接种到MH固体培养基上。将培养物在37 ℃下保持16~18 h。将MH固体培养基中的单个菌落浸入5 mL MH液体培养基中，并在以下条件下在摇床中培养：37 ℃，220 rpm，5 h。）

1.2.3 细菌存活率测试 参考GB 4789.2-2016菌落总数测定方法，对四种消毒剂的应激培养物和空白对照培养物进行菌落计数，使用营养琼脂平板确定每种细胞悬液中的活菌数量，培养、观察并计算。

1.2.4 消毒剂胁迫后菌株消毒剂抗性测定重复1.2.1中所述方法，挑取提前制备好的消毒剂胁迫菌株的新鲜菌落进行消毒剂抗性测定。

1.2.5 微量肉汤稀释法药敏测试 MIC是指抑制受试微生物可见生长所需的最低抗生素浓度，通过肉汤微量稀释法测定。在无菌96孔板的第一孔中加入200 μL的1024 μg/mL抗菌溶液，然后用无菌水以两倍的梯度稀释至0.015 μg/mL，每个梯度3个重复；在配置好的不同抗生素浓度梯度的96孔板中每孔加入100 μL待测细菌溶液；在3个空孔中加入200 μL液体培养基作为空白。将消毒剂胁迫后菌株的新鲜菌液稀释至最终浓度约为6 log10 CFU/mL，用于抗生素药敏测试。取上述菌悬液按照100 μL/孔加至配置好的药敏板中，每个孔中液体的最终体积为200 μL。置于恒温恒湿培养箱内37 ℃孵育18~22 h，肉眼观察读取结果（结果解释参照CLSI药敏试验解释标准），以大肠杆菌（ATCC 25922）菌株为质控菌株。

1.2.6 结果注释使用CLSI标准推荐的参考值（见表1）测定受试抗生素对鼠伤寒沙门氏菌的MIC折点值。

注：由美国临床和实验室标准协会（CLSI）提出。MIC: 最小抑制浓度(Minimal Inhibitory Concentration) 抑制微生物可见生长所需的最低抗生素浓度。

Note: As proposed by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) in America. Mic: ( Minimal Inhibitory Concentration ) the lowest concentration of the antibiotics required to inhibit the visible growth of the microorganism.

1.2.7 统计分析所得数据用SPSS 26.0统计软件包进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 ATCC 14028s对四种消毒剂的MIC值

鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028s对CH、SH、BC和CTPC的MIC分别为4、2、16、16 μg/mL（见表2）。ATCC对季铵化合物的抗性高于对含氯消毒剂的抗性。有报道，肠杆菌对BC的MIC < 30 μg/mL为敏感，MIC于30~50 μg/mL为低水平耐药，MIC > 50 μg/mL为高水平耐药[15]。说明标准菌株14028s对四种消毒剂均敏感。随后用0.5倍MIC浓度的四种消毒剂（即2 μg/mL的CH；1 μg/mL的SH；8 μg/mL的BC；8 μg/mL的CTPC）分别胁迫ATCC菌株。

表 2 ATCC14028s对消毒剂的MIC值

2.2 细菌存活率

四种消毒剂胁迫菌株的活菌量均有不同程度的减少（见图1）。经0.5 MIC浓度（2 μg/mL）的氯已定胁迫后，ATCC 14028s的活菌量减少为原来的0.34倍（<0.0001）；经1 μg/mL的次氯酸钠胁迫后，ATCC 14028s的活菌量减少为原来的0.52倍（<0.005）；经8 μg/mL的苯扎氯铵胁迫后，ATCC 14028s的活菌量减少为原来的0.35倍（<0.0001）；经8 μg/mL的氯化十六烷基吡啶后，ATCC 14028s的活菌量无显著性变化（＞0.05）。采用单因素显著性分析（t-test）计算四组胁迫菌株分别与对照组之间的差异显著性。

图 1 消毒剂胁迫后ATCC14028s的活菌量

注：****表示<0.0001，有显著性差异；***表示<0.005，有显著性差异；ns表示＞0.05，无显著性差异。

Note: ****,<0.0001, with significant difference; ***,<0.005, with significant difference; ns,＞0.05, without significant difference.

2.3 消毒剂胁迫后ATCC 14028s对消毒剂的抗性变化

经0.5 MIC浓度（2 μg/mL）的氯已定胁迫8 h后，菌株对CH的抗性增强2倍（见表3），对其他三种消毒剂的抗性未发生变化，MIC由4 μg/mL增加到8 μg/mL。经0.5 MIC浓度（8 μg/mL）苯扎氯铵刺激后，菌株对CH的MIC值由4 μg/mL增加到8 μg/mL，抗性也增强了2倍。而0.5 MIC浓度的SH和CTPC刺激并未改变四种消毒剂的抗性。消毒剂胁迫后ATCC 14028s的抗性变化微弱且只有氯已定抗性在CH和BC胁迫后微弱增强。

表 3 ATCC14028s经消毒剂胁迫后对四种消毒剂的抗性变化

2.4 消毒剂胁迫后ATCC 14028s对14种抗生素耐药变化

经CH、SH胁迫后，ATCC 14028s对环丙沙星的MIC值由0.015 μg/mL增加至0.06 μg/mL，耐药性增加4倍（见表4）；对氨苄西林的耐药性增加2倍，MIC值由2 μg/mL变为4 μg/mL；对庆大霉素的耐药性减弱2倍，MIC值由32 μg/mL变为16 μg/mL（＜0.05）。经BC、CTPC胁迫后，ATCC 14028s对环丙沙星的MIC值由0.015 μg/mL增加至0.06 μg/mL，耐药性增加4倍；对四环素的耐药性MIC值由2 μg/mL增加至8 μg/mL，耐药性增加4倍；对庆大霉素的耐药性增强4倍，MIC值由32 μg/mL增加至128 μg/mL（＜0.05）。ATCC 14028s经消毒剂胁迫后对链霉素、甲氧苄啶等10种抗生素的耐药性无变化（＞0.05）。

表 4 ATCC14028s经消毒剂胁迫后14种抗生素的耐药性变化

注：+，MIC值增加了0.5到2倍（＜0.05）；++，MIC值增加了2到4倍（＜0.05）；-，MIC值减少了0.5到2倍（＜0.05）；0，MIC值未发生变化（＞0.05）。S代表敏感；R代表耐药。

Note: +, 0.5- to 2-fold increase in MIC (0.05). ++, 2.1- to 4-fold increase in MIC (0.05). -,0.5- to 2-fold decrease in MIC (0.05). 0, no change (> 0.05). S: Susceptible; R: Resistant.

3 讨论

消毒剂胁迫后菌株的活菌量均有不同程度的减少，这种亚致死胁迫会迫使细菌产生应激反应，进而提高对某些环境或抗菌剂的抗性。本研究表明被检测的鼠伤寒沙门氏菌菌株最初对所检测的消毒剂敏感，四种消毒剂胁迫对沙门氏菌消毒剂抗性几乎无影响，只有氯已定的抗性在CH和BC胁迫后略微增强。据报道，细菌长期暴露于消毒剂环境中培养、传代将会提高菌体对消毒剂的抗性[16]。而本研究中使用的消毒剂的短期胁迫则不会改变沙门氏菌对消毒剂的抗性。

在目前的研究中，被检测的鼠伤寒沙门氏菌菌株最初对所检测的抗生素敏感，但当ATCC暴露在四种消毒剂胁迫下时，它对环丙沙星抗生素耐药性增加。其中两种含氯类消毒剂CH和SH均使环丙沙星和氨苄西林的耐药性增强，庆大霉素耐药性减弱。两种季铵盐类消毒剂也引起了相同的抗生素耐药性变化，BC和CTPC均使环丙沙星、四环素和庆大霉素耐药性提高。如果这代表了一个更广泛的现象，它可能部分解释了食品加工中消毒剂的广泛使用导致了沙门氏菌耐药性的出现。沙门氏菌暴露于同一类别消毒剂环境中，引起的抗生素耐药变化相同。季铵盐类消毒剂与含氯消毒剂对抗生素耐药性的影响存在差异，推测不同种类的消毒剂作用诱发了不同的耐药机制。抗生素的滥用和广泛使用导致抗生素抗性的获得，消毒剂的使用也同样会造成抗生素耐药的出现[1]。

QACs类消毒剂会引起的外排泵过表达，这可能会导致多药外排泵与氟喹诺酮类药物产生交叉耐药性；细菌经QACs胁迫后产生的应激反应可能会促进喹诺酮抗性确定区域中的突变[12]，从而提高了对喹诺酮类药物环丙沙星的耐药性。环丙沙星作为喹诺酮类药物以细菌的脱氧核糖核酸（DNA）为靶，妨碍DNA回旋酶，进一步造成细菌DNA的不可逆损害。含氯消毒剂的氯化作用对DNA造成了轻微的损伤，增加氯浓度导致更多的DNA和mRNA损伤[17]，推测含氯消毒剂胁迫会损坏沙门氏菌中环丙沙星的DNA作用靶点，提高了对环丙沙星的耐药性。

本研究中观察到的其他抗生素耐药性变化可能与以下一种或多种机制有关:细胞壁抗生素结合位点的减少，负责外流泵合成和运行的基因的扩增，以及应激休克蛋白的诱导。细菌可以通过下调细胞壁中的青霉素结合蛋白（如PBPs等）来应对不同消毒剂的不利环境挑战，这可能是氨苄西林耐药性提高的原因。细菌可以通过增强外排泵（如四环素外排蛋白TetA）外排作用降低抗生素细胞质浓度的能力，这是引起四环素耐药性增加的重要机制。并且可以通过合成伴侣蛋白来维持细菌的存活应激或抗生素挑战期间的蛋白质功能[18]。

4 结论

沙门氏菌经消毒剂胁迫会产生应激反应，这种对消毒剂的适应性反应导致对其他应激的抵抗力-抗生素抵抗力发生变化，而对四种消毒剂的抗性几乎不变。含氯消毒剂胁迫菌株对环丙沙星和氨苄西林的耐药性显著增，对庆大霉素的耐药性减弱；季铵盐消毒剂胁迫菌株对环丙沙星、四环素和庆大霉素的耐药性提升。消毒剂可以与抗生素产生共同耐药，诱发对消毒剂耐药及抗生素耐药的“双耐药菌株”的产生。本研究为食品加工中消毒剂的规范性使用提供指导，为深入研究消毒剂诱发的耐药性产生机制和进一步改进工业界干预措施和风险管理提供了有价值的信息。

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The Resistance and Drug Resistance ofTyphimurium ATCC 14028s by Disinfectants Stress

WU Shang1, YANG Yang1, SUN Jia-di1, YANG Jia2, ZHANG Yin-zhi1, SUN Xiu-lan1*, JI Jian1*

1.214122,2.225000,

To explore the disinfectant after the stress ofTyphimurium ATCC14028s resistance and resistance to antibiotics, this study selected Sodium Hypochlorite, Chlorhexidine (97%), Benzalkonium Chloride (80%) and Cetyl Pyridine Chloride (98% or higher) respectively stress ofTyphimurium ATCC14028s, stress strain after the determination of disinfectant resistance and antibiotic resistance. The results showed that the resistance ofto four kinds of disinfectants was almost unchanged after stress, but the resistance to some antibiotics changed significantly. The resistance ofstrains to Ciprofloxacin and Ampicillin increased significantly after stress of Chlorhexidine and Sodium Hypochlorite, and the resistance to Gentamicin decreased. The resistance to Ciprofloxacin, Tetracycline and Gentamicin of strains stressed by Benzalkonium Chloride and Cetylpyridine Chloride was increased. Therefore, the overuse of disinfectants has theoretical significance for the prevention and control of drug-resistant bacteria in food processing.

; disinfectant; resistance; drug resistance

R378.2+2

A

1000-2324(2021)01-0013-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2021.01.003

2020-04-12

2020-07-21

“十三五”国家重点研发计划(2017YFC1600102);2020年度江苏省市场监督管理局科技计划项目(KJ204139)

吴上(1996-),男,在读硕士,专业方向:食品安全与质量控制. E-mail:744589782@qq.com

Author for correspondence. E-mail:sxlzzz@jiangnan.edu.cn; jijian@jiangnan.edu.cn