新西兰匍柄霉（Stemphylium eturmiunum）HSP42基因沉默突变株的构建及其生物学特性

万能,王群,王石,徐文梦,赵丽丽,孙文秀,张修国*,李伟*

新西兰匍柄霉（Stemphylium eturmiunum）HSP42基因沉默突变株的构建及其生物学特性

万能1,王群2,王石2,徐文梦2,赵丽丽2,孙文秀1,张修国2*,李伟1*

1. 长江大学生命科学学院, 湖北 荆州 434025 2. 山东农业大学植物保护学院;山东省蔬菜病虫生物学省级重点实验室, 山东 泰安 271018

丝孢真菌是自然界中一类广泛存在的真核微生物，匍柄霉属()是丝孢真菌中的一个重要类群，而新西兰匍柄霉（）是其中的典型种，是研究丝孢真菌有性、无性进化的适用材料。热休克蛋白（Heat shock protein，HSP)，是一类进化保守的蛋白质家族，在生物体中发挥着重要的生理功能。本研究以为实验材料，克隆鉴定了热休克蛋白42（）基因，通过根癌农杆菌介导的匍柄霉属遗传转化系统，获得了（03717）基因沉默菌株。以WT菌株为对照，对03717沉默菌株的生物学特性进行观察发现：沉默03717后，其菌落生长减缓，菌丝细胞核分布不均匀；沉默03717后其产分生孢子时间推迟，产孢量减少，且经低温诱导后无法产生子囊壳及子囊孢子，说明基因对的无性和有性发育具有重要影响。本研究为有性无性发育及小热休克蛋白功能研究提供了更多依据。

新西兰匍柄霉; 热休克蛋白; 基因沉默

丝孢真菌是真菌中一个重要的类群，因其菌落外观干燥，质地疏松，形态较大，繁殖能力强从而成为实验室一类重点研究的微生物[1]。丝孢真菌主要以无性生殖方式繁殖，如暗色丝孢真菌（Dematiaceous hyphomycetes）450余属的绝大多数种都以无性生殖方式生存繁殖，仅少数具有有性型[2]。匍柄霉属为格孢腔菌（）类，是重要的丝状子囊真菌，而本研究所用的是其中的典型种，是能够产生有性态的少数菌种之一，对于研究匍柄霉属真菌的有性无性生殖进化具有重要的意义[3]。匍柄霉属的大部分种是农业经济作物的致病菌，能引起多种蔬菜病害，如大蒜叶枯病、洋葱叶枯病、甜菜叶斑病、菠菜叶斑病等[4]。因此，对匍柄霉属真菌的有性无性发育研究有重要的意义。

热休克蛋白（Heat shock protein，HSP)，也称热激蛋白，是生物体受到环境中物理、化学、生物等刺激时产生应激反应而合成的一类蛋白质[5]。HSP是一类庞大的蛋白质家族，在进化上较为保守，在各种生物体中都广泛存在，并且发挥着重要的生理功能[5]。HSP种类繁多，最为常见的是以它们的分子量大小将其分为HSP60、HSP70、HSP90、HSP110及小分子热休克蛋白sHSP几个家族[6]。近年来，对HSP家族的研究取得了许多重要进展，尤其是对一些大分子热休克蛋白的研究更加的深入和细致[5]。研究发现，在治疗肿瘤的放射过程中，细胞内的HSP70和HSP90会高水平的表达，从而对机体的先天免疫系统产生强有力的刺激，增强免疫功能[7]。也有研究发现，HSP90在生物体的发育进化中也发挥独特的作用[8]。对sHSP的研究也有了一定的成果，其对维持骨骼肌细胞骨架结构稳定和帮助其在损伤修复方面起着关键作用[9]。然而，在真菌中的sHSP研究仍需要我们进一步的探索。在本研究中，发现了基因对匍柄霉属真菌的有性无性发育具有重要影响，也为sHSP的研究提供了更多的素材。

农杆菌介导转化(ATMT)技术在真菌的遗传转化研究中得到了广泛的应用，使得许多真菌基因功能得以阐明[10]。根癌农杆菌能够将外源DNA质粒插入到宿主基因组中，外源基因会在宿主内得以表达，从而研究基因的功能[11]。基因沉默是研究真核生物基因功能的一种重要手段，而真菌细胞中的基因沉默是一种典型的RNAi途径，是由双链RNA引发的转录后基因沉默机制[12]。RNAi技术在近年来得到了不断的研究和发展，已经越发成熟。在和粗糙脉胞菌（）中使用了发夹结构RNA介导的基因沉默，其沉默效率是传统RNAi途径沉默效率的2.5倍左右[13]。在丝孢真菌中，利用ATMT技术将带有发卡结构RNA的外源重组质粒导入宿主细胞中，从而引发目的基因在宿主基因组中的沉默，进一步研究基因的功能[14]。

1 材料与方法

1.1 材料来源

（EGS 29-099）菌株是与U.S. Army Natick Laboratories的Emory G. Simmons交换获得（存放于山东农业大学植物保护学院植物病原真菌学和真菌资源研究室）。沉默载体pCIT和pCH由华中农业大学姜道宏老师实验室惠赠，大肠杆菌DH5α购自TransGen Biotech corporation；农杆菌Agl-1和Agro菌株由吉林大学张世宏老师提供。

1.2 热休克蛋白42基因沉默载体的构建

采用常规的CTAB法提取全基因组DNA，从其中找出基因（ORF-03717)所对应的完整核苷酸序列，并以基因组DNA为模板，利用带有、识别位点的特异性引物PCR扩增得到03717基因的全长核苷酸序列，并将基因的启动子区和基因的200 bp左右（共500 bp）分别正向和反向连接到沉默中间载体pCIT上，形成一个发卡结构。用Amp抗性的LB培养基进行筛选，经菌液PCR检测后测序，便得到重组载体pCIT-03717。分析03717基因及沉默载体pCIT、pCH的多克隆酶切位点信息，选出和酶切位点，分别对pCIT-03717及pCH进行双酶切，回收纯化带有基因的片段和线性化载体pCH，然后连接两回收产物。通过大肠杆菌Trans5α 进行转化实验，并用Kana抗性的LB培养基进行筛选。通过菌液PCR检测和测序公司测序后，获得重组沉默载体质粒pCH-03717。特异引物如下：

03717s-1F CCATCGATGAACTGATGCCTGGAGGTGT

03717s-1R CCCAAGCTTCATGGGCTTCGTTATCAGAAC

03717s-2F CGGGATCCGAACTGATGCCTGGAGGTGT

03717s-2R TCCCCCGGGCATGGGCTTCGTTATCAGAAC

1.3 根癌农杆菌介导的S. eturmiunum遗传转化

参考熊晨琳[15]等建立的根癌农杆菌介导的遗传转化系统，首先筛选抑制WT生长的HygB最适浓度，然后制备WT菌丝悬浮液，最后进行根癌农杆菌介导的遗传转化。连续3次筛选后，仍可在HygB抗性的PDA平板上生长的菌落被认为是疑似沉默转化子。

1.4 沉默转化子的筛选和验证

按照OMEGA公司的RNA提取试剂盒提取疑似沉默转化子的RNA，并按照南京诺唯赞公司的反转录试剂盒说明书合成cDNA，以WT cDNA为对照，进行qRT-PCR分析，检测03717基因在沉默转化子中的沉默效率，沉默效率大于75%的即为沉默转化子。

1.5 沉默转化子的生物学性状分析

沉默转化子的生物学性状分析主要包括：菌落形态观察及生长速率测定，菌丝细胞核定位DAPI观察，显微镜观察分生孢子和有性态产生情况。具体方法参考熊晨琳[15]对敲除转化子的生物学性状分析。

2 结果与分析

2.1 HSP42基因克隆及沉默载体pCH-Gene的构建

（03717）基因序列全长为1035 bp，编码344个氨基酸，预测分子量为37.252 kDa。克隆目的条带在1000 bp处（图1）。

综合pCIT、pCH载体图谱和03717基因序列，选择合适的酶切位点，将03717基因先后连接到pCIT及pCH上，最终得到重组沉默载体pCH-03717。利用冻融法将重组沉默载体质转入农杆菌感受态中，经PCR检测后，保存阳性克隆菌液用于后续农杆菌介导的沉默转化试验。

图 1 03717基因PCR扩增结果

2.2 根癌农杆菌介导的S. eturmiunum遗传转化

将WT菌块接种到含不同浓度HygB的PDA培养基上，观察菌落的生长状况。如图2所示，在没有HygB抗性的PDA平板上，菌株正常生长；随着HygB浓度越来越高，菌丝的生长逐渐受到抑制；当HygB浓度增加到25 µg/mL时菌丝生长受到完全抑制。因此，最终确定筛选HygB的浓度为25 µg/mL。通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法将重组沉默载体质粒转移到WT菌株中后，通过PDA固体培养基（含25 µg/mL HygB抗性）筛选疑似的沉默转化子。

2.3 沉默转化子的获得及验证

连续三次筛选后仍然可以在HygB抗性的PDA平板上稳定生长的菌株被视为疑似沉默转化子。提取疑似沉默转化子和WT菌株的总RNA，反转录为cDNA，并以WT cDNA为对照，检测几个疑似沉默转化子中03717基因的沉默效率，检测结果如图3。最终筛选出2个高效的03717沉默转化子，沉默效率高达94%以上。

图 3 03717在S. eturmiunum WT和沉默转化子中的相对表达量

2.4 转化子的生物学性状分析

2.4.1菌落形态观察及生长速率测定对WT菌株和03717沉默转化子菌株同时进行培养，观察菌落形态并测定生长速率。如图4所示，沉默转化子与野生型菌株相比呈现出菌落直径略微减小、菌落颜色变浅及菌丝变紧密等特性；生长速率测定也显示，03717沉默转化子的生长速率略小于WT菌株的生长速率。说明03717基因对的菌落形态及菌丝生长发育具有一定调控作用。

图 4 S. eturmiunum WT及沉默转化子菌落生长形态及生长速率

A：菌落生长形态；B: 生长速率测定

A：Colony growth morphology; B：Growth rate assay

2.4.2WT菌株和沉默转化子的菌丝细胞核照相将插片培养4~6 d的WT菌株和沉默转化子菌株爬片取出，通过DAPI染色制成临时玻片，在40×荧光显微镜下观察细胞核定位。如图5所示，WT菌丝细胞核分布较为均匀，03717沉默转化子细胞核分布无规律，且部分密集。结果证明，03717基因对的菌丝细胞核分布具有调控作用。

图 5 S. eturmiunum野生型菌株和沉默转化子核定位

2.4.3 分生孢子和有性态产生情况通过显微观察分生孢子和子囊壳产生情况，结果如图6所示。沉默03717后仍然产生分生孢子，但产孢时间有所推迟，产孢数量也有所减少，结果说明03717基因对无性生殖有一定影响；WT菌株在20 d左右能够正常产生子囊壳，4到5周就可产生子囊孢子，而03717沉默转化子在6周后只能产生不成熟的子囊壳，经低温诱导后无法产生子囊孢子，结果说明03717基因对有性生殖有较大影响。

图 6 沉默转化子分生孢子和子囊产生情况

A：分生孢子产生图；B：子囊产生图；C：子囊孢子产生图

A：Conidia production ; B：Sporulation production ; C：Ascospore production

3 讨论

本研究以匍柄霉属典型种为材料，用根癌农杆菌介导的遗传转化方法及发夹结构RNA介导的基因沉默技术对基因进行了基因沉默，获得了其沉默转化子菌株，并观察其生物学性状。研究发现，沉默基因后，其菌落生长速率变慢，菌丝细胞核分布由较为均匀稀疏变得部分密集且无规律；沉默后其无性分生孢子产孢时间推迟且产孢量减少，沉默转化子尚能产生不成熟的用于有性发育的子囊壳，但经低温诱导后无法产生子囊孢子。从以上结果可以看出，基因对的无性及有性发育均有较大的影响。大分子热休克蛋白在真菌中的研究已有了许多重大的进展，如HSP90通过介导植物免疫信号转导途径，参与先天免疫受体和蛋白激酶的活化与稳定，从而成为植物免疫中的重要组成成分[16]。然而，sHSP的功能在真菌中尚未得到太多的发现和验证。本研究证明了对丝孢真菌的无性有性发育具有一定的影响，这为后人对sHSP的研究提供了更多的思路和素材，但影响无性有性发育的分子机制还未得到揭示，仍然需要我们进一步的探索。

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Construction and Biological Characteristics ofGene Silencing Mutant from

WAN Neng1, WANG Qun2, WANG Shi2, XU Wen-meng2, ZHAO Li-li2,SUN Wen-xiu1, ZHANG Xiu-guo2*, LI Wei1*

1.434025,2.271018,

Filamentous fungi is a kind of eukaryote which exists widely in nature, theis an important group of filamentous fungi, and theis a typical species, is a suitable material for studying sexual and asexual evolution of filamentous fungi. Heat shock protein (HSP), a class of evolutionarily conserved protein families, plays an important physiological function in organisms. The heat shock protein 42() gene was cloned and identified byas the experimental material, and the(03717) gene silencing strain was obtained bymediated genetic transformation system of. TakingWT strain as control, the biological characteristics of 03717 silent strain were observed: the colony growth slowed down and the mycelium nucleus distribution was uneven after silencing 03717; after silencing 03717, the conidia production time was delayed and the perithecia and ascospore could not be produced after low temperature induction. It shows that heat shock protein 42 gene has important effect on asexual and sexual development of. Forsexual development and small heat shock protein function, this study provides more evidence.

; heat shock protein; gene silencing

S763.15

A

1000-2324(2021)01-0001-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2021.01.001

2020-03-18

2020-05-08

国家大宗蔬菜产业技术体系(CARS-25-03B)

万能(1995 -),男,硕士研究生,研究方向:细胞生物学. E-mail:2514961357@qq.com

Author for correspondence. E-mail:zhangxg@sdau.edu.cn; wetli@yangtzeu.edu.cn