红松多糖的提取工艺及生物活性研究进展

刘垠泽，李沛檑，乔连成，吴恒梅*

（1. 佳木斯大学生命科学学院，黑龙江佳木斯 154007；2. 桦南县林草事业发展中心，黑龙江佳木斯 154007）

红 松（Pinus koraiensisSieb. et Zucc.）为松 科（PinaceaeLindl.）松属（PinusL.）常绿乔木，始载于《名医别录》，又名红果松、朝鲜松、海松等。耐寒性强，常见于我国小兴安岭至长白山一带［1］，生于海拔150～1 800 m 的棕色森林土中，是东北地区特有的果材兼用型植物，也是我国重要的经济型林木，于1999 年被国务院立为国家二级重点保护野生植物。国外仅在日本、朝鲜和俄罗斯的小部分地区有分布［2］。红松树干常因结构细腻且耐腐蚀性强而被用作工业原料，早在古希腊时期，松树皮就被欧洲人用作治疗外伤，也可从中提取松节油、栲胶。红松球果中松籽被开发、出口为滋养食用品，《本草纲目》纪录了松塔、松针的医药价值，可磨粉入药，医咳喘、湿气、炎症、心神不安等病症。

多糖是维持生命活动所必需的四大基本物质之一。随着国际分子水平研究的进步，各国对多糖的研究愈发重视，认为二十一世纪将是多糖的世纪［3］。现代研究表明，红松中含有萜类、多糖、多酚等有效化学成分，其不同部位的水提物具有抗氧化、抗病毒和降血脂等药理活性。该文对红松多糖的提取工艺及生物活性进行简要综述，以期为红松资源的合理开发利用提供参考。

1 红松多糖的提取工艺

多糖的提取技术是天然产物研究中不可或缺的分支，植物多糖的毒副作用极低，应用领域宽泛。目前成熟的提取技术繁多，针对红松多糖提取层面，国内研究多集中于提取条件的优化。不同方法提取出的多糖构象、提取量和药理活性有差别，红松各部分均含有一定量的多糖，提取时应先将材料粉碎烘干，根据提取原料部位的不同，酌情考虑是否进行预处理溶解脂类物质。

1.1 溶剂浸提法

溶剂浸提法即根据相似相溶原理，按照生物活性成分的溶解度不同选择合适的溶剂，将胞内有效物质迁徙至溶剂中，再进行分离纯化。水、酸碱溶液等是常用于提取多糖的溶剂。

水提法是传统的多糖提取方法。相较于冷水提取，溶剂温度的提升可使分子移速加快，显著增加多糖提取得率。水提法简单经济、干扰成分少、可工业化应用，但得率低且耗时，不能确定高温下是否改变多糖的化学结构。在水提法中，提取参数决定了最后的多糖得率，因此控制适宜的提取条件显得大有可观。当提取物中含糖醛酸或酸性多糖时，可选用碱提取法。通过控制浓度，使细胞在碱性条件下破裂，释放内容物从而进行提取，提取速度和效率比水提法要略高，但操作繁琐、易产生杂质，碱浓度过高时将会损害多糖结构［4］。

曲航［5］先对影响松仁多糖提取率的因素进行参数优化，以多糖得率为响应值，进行响应面分析实验考察最优提取参数，得到最优工艺方案为：固液比1：40 g·mL-1，温度95℃，时间1.5 h，提取3 次，提取率为9.26%±0.10%。丁宁［6］采用水提醇沉法，将料液比、提取时间、提取次数选为实验条件，设置单因素试验并确定因素适宜范围，在此基础上设置三因素三水平正交试验进行提取工艺的优化，结果表明影响红松松籽壳多糖得率的强弱顺序为：固液比>提取次数>提取时间，最佳提取参数为：固液比1：15 g·mL-1，提取时间2 h，提取3 次，在此条件下多糖平均得率为2.9%。杨鑫等［7］在单因素考察的基础上进行正交试验，将松塔多糖提取率作为评价指标，通过其方差分析结果可知，浸提温度和固液比对多糖得率呈显著性影响，主次顺序为：固液比>浸提温度>浸提时间，当料液比为1：12 g·mL-1，浸提温度100℃，浸提时间4 h 时多糖得率最高，为1.52%。红松提取物内含水溶性酸性多糖的比例约16%～23%［8］，因此也可选用碱提取法进行多糖提取。

1.2 超声辅助提取法

利用声波的振动传播改变细胞外压力，溶液内产生微气核空化泡，这些空化泡在压缩到极限时会崩溃释放能量，形成局部的高温高压环境，有助于加速溶质扩散，细胞瞬时破裂释放出多糖等化学物质。此法适应性强，在常温下即可操作，过程中产生的热效应会使溶液温度基本维持在57℃，有水浴加热作用，极大提高了多糖提取效率。与传统的水提取相比，超声辅助法的材料损失率更低、提取时间短、得率和质量有所增加。当超声功率、时间等因素设置不当时，也存在多糖结构被改变的可能性，且由于设备受限问题，大规模的工业化生产还需要一定时间。

李明谦［9］选用超声辅助水提法提取红松松籽壳多 糖（Pinus koraiensis pinon shell polysaccharides，PPSP），设计正交试验优化提取工艺，从固液比、提取温度、浸提时间和提取次数四因素层面考察，分析各因素对多糖提取率的影响，得到如下顺序：提取温度>浸提时间>浸提次数>固液比，其中温度和时间对多糖含量的影响呈极显著差异。提取最优参数为：固液比1：6 g·mL-1，温度85℃，时间45 min，提取2次，此时PPSP总含量达最高值54.41%。李桂娟等［10］在超声功率恒定450 W 条件下，通过改变固液比、提取时间、提取温度和提取次数，设计正交试验以确定最佳提取工艺，在该研究中提取时间对得率影响最低，影响顺序依次为：提取温度>浸提次数>固液比>浸提时间，当固液比为1：50 g·mL-1，温度60℃，时间30 min，提取1 次时多糖得率最高，为44.26%。在原料、提取次数和料液比相同的情况下，超声辅助比水提多糖得率高9.94%，所需温度更低，在节能的同时更能保障多糖活性结构的稳定。

1.3 微波辅助提取法

利用电磁波透过细胞壁辐射溶剂和细胞液，使细胞内极性物质吸能产热汽化膨胀，细胞内外产生压力差，导致细胞壁破裂，有效成分流出溶解。此法节能、高效、重现性好，但也需严格把控功率的设定，若时间过久或功率较高，将会导致多糖浸出率低、糖苷键断裂等缺陷。

王振宇等［11］在单因素考察的基础上，以松籽多糖含量为考察指标进行正交试验，分析固液比、微波功率、处理时间和浸提时间对提取率的影响，结果表明固液比和微波功率对多糖得率有显著性影响，其余因素的影响不显著，当固液比为1：15 g·mL-1，功率320 W，处理时间5 min，浸提时间60 min时达到最优提取条件，多糖得率为6.01%。与传统水提法相比，微波辅助在用料相同的情况下，所需溶剂减少了1/4、时间节省一半、多糖得率升高0.1%。

1.4 生物酶提取法

酶解法是多糖提取中较为温和高效的方法，其原理是根据多糖化合物的化学组成特性差异，在溶剂中选择性的加入生物酶，降低活化能，软化水解细胞壁，增大细胞通透性，促使胞内活性成分流于溶剂中［12］。对于植物性多糖，通常选用木瓜蛋白酶、果胶酶、纤维素酶等生物酶进行提取，在提取多糖的过程中，多酚等物质也会被分离提取，部分提取物的质量还会在酶的作用下增加。此法在温和条件下即可操作，提取率高、能有效避免降解多糖的生物活性且易除杂质，但在操作时要确保条件适宜、酶活性稳定不失活，由于酶解法成本较高、提取条件严格，工业化应用不太现实。

贺便等［13］采用正交试验优化超声辅助酶解法提取松针多糖，在提取中以1：1 的比例加入果胶酶和纤维素酶，各因素对多糖得率影响顺序为：酶添加量>提取温度>超声时间>固液比>酶解时间，当固液比为1：25 g·mL-1，超声时间25 min，酶解时间2 h，提取温度60℃，酶添加量5% 时为最佳提取工艺，此时松针多糖提取率为3.97%。

1.5 超临界流体萃取法

超临界流体的密度相似于液体且扩散系数远大于液体，有较强的渗透溶解力，能够迅速渗透进入细胞内，适合作为溶剂进行萃取实验。对于某些特定物质来说一般存在一个临界点，当处于超临界状态下，提取物被隔段萃取，恢复正常气压后，提取物与气体分离溶于溶剂中，达到萃取效果［14］。此法工艺简便、过程易调控、萃取效率高且无溶剂残留，能够确保多糖生物活性稳定。王振宇等［15］将红松籽壳磨粉、过40～60 目筛，以过氧化值为参考设计正交试验，得出最佳萃取参数为：提取温度35℃，萃取压力40 MPa，提取时间2 h，得率为2.4%。

1.6 阴离子反向胶束体系萃取法

阴离子反向胶束体系萃取技术在多糖提取方面属于新兴技术，用该种方法提取植物多糖是一种协同过程，即溶液在水相形式下接触反胶束微粒，此时多糖移入微粒中属于萃取过程；当该微粒接触其他水相时多糖会回到水相中，该过程属于反萃取过程，经过整个萃取与反萃取后，多糖化合物就被分离出来［16］。此法快速高效、能够保障多糖生物活性不流失，但有关阴离子反向胶束体系萃取法提取红松多糖的研究报道罕见，需在今后进一步研究试验，完善相关技术资料。

2 红松多糖的生物活性

2.1 抗氧化活性

自由基是含有未成对电子的原子基团，具有强氧化性。自由基内的单电子为形成稳定结构，常倾向和其他原子结合，因此自由基常处于活泼不稳定状态。机体内常见自由基有：羟自由基、烷氧基、超氧阴离子等。在正常状态下，机体的抗氧化系统会严格控制自由基含量，使其处于动态平衡。当体内自由基累积过多时，会产生氧化胁迫，对各细胞结构和功能造成损伤、导致免疫系统紊乱、加速衰老并且诱发出多种疾病［17］。1956 年被提出的自由基学说是目前公认的衰老学说之一，而具还原力的抗氧化物质能够对多余自由基起到阻断清除作用，达到延缓衰老的效果。

多糖属于外源性抗氧化物质，目前已发现许多药用植物多糖具有抗氧化活性，植物多糖通过增强机体内抗氧化酶的活性从而阻断氧化反应过程，利用多糖内的羟基结构络合氧化必需的金属离子，也可以直接作用于自由基抑制其增多。

付昊雨等［18］进行小鼠体内抗氧化试验，结果表明高浓度的松籽壳多糖提高了肝脏血清中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，呈极显著性影响；从总体数据来看，在低浓度下多糖依然提高了小鼠的抗氧化活性。通过进行体外抗氧化实验测定松塔多糖的抗氧化活性，以抗坏血酸的清除率作为对照，结果显示当多糖浓度为15 mg·mL-1时，对ABTS•+的清除率达到80%；当浓度持续升高到30 mg·mL-1时，ABTS•+的清除率升高幅度趋于平缓，羟基自由基清除率达80%［19］。刘超［20］在测定松塔粗多糖还原能力和DPPH自由基清除率的研究中发现，不同组分的粗多糖都具有一定的体外抗氧化活性，且抗氧化能力与多糖浓度呈正相关。沈巳焱［21］在对比红松不同部位多糖的半最大效应浓度（Concentra⁃tion for 50% of maximal effect，EC50）值时认为，多糖分子量、单糖组分的区别会影响清除自由基的能力。由于松针多糖分子量小、D-葡萄糖和D-木糖含量多，因此羟基自由基清除率最高，在8 mg·mL-1时就达到了67.72%；而松塔多糖中糖醛酸和D-甘露糖含量高，ABTS•+清除力和还原力强于其他部位的多糖。

2.2 抗肿瘤活性

肿瘤是机体局部细胞在刺激因素的作用下，增生与异常分化形成的新生物，会严重威胁到机体正常生命活动。目前已有多种植物多糖化合物被证实有抗肿瘤活性，这些多糖大都有硫酸基。植物活性多糖对机体正常细胞的毒副作用很小，能够通过增强机体免疫系统活性对抗肿瘤细胞，或者抑制肿瘤细胞周期、诱导其凋亡［9］。

吕永俊等［22］选用三种肿瘤细胞分别给小鼠接种0.2 mL，以此考察红松多糖的抗肿瘤活性，结果表明60 mg·kg-1的松塔多糖对鼠肉瘤细胞的抑制率达48.9%，有极显著性影响；60 mg·kg-1的松籽壳多糖对宫颈癌细胞平均抑制率为38.2%，对肝癌腹水型小鼠的生命延长率有21.4%。有研究显示，100 mg·kg-1的松塔多糖对荷瘤小鼠的毒副作用小，抑瘤率为33.07%，有显著性影响；当浓度达到200 mg·kg-1时，抑瘤率升高至48.33%，但毒副作用也随之加强［23］。

2.3 免疫调节活性

免疫调节是机体执行免疫应答过程中维持自身稳定的生理功能。植物多糖能够作为免疫调节剂以多种途径参与生理活动，增强巨噬细胞吞噬作用、结合坏死细胞清除病原体；促进T 淋巴细胞免疫；激活补体系统；促进细胞因子的生成。

有研究者运用酶联免疫吸附测定法对松籽壳多糖进行免疫调节研究，结果显示：100 mg·kg-1的多糖对小鼠脏脾中T细胞生长因子蛋白含量有升高作用；200 mg·kg-1的多糖使血清干扰素蛋白含量比对照组增加了54.56 ng·L-1，使肿瘤坏死因子上调，较对照升高了30.67 ng·L-1；该实验证实红松多糖能够间接活化某些细胞以达到调节免疫功效，具有免疫调节活性［9］。T Baba 等［24］证明松籽壳多糖能增强激活小鼠腹腔内巨噬细胞的吞噬能力，随之激活T 细胞对异体抗原的反应性。孙芳［25］采用迟发型变态反应和碳廓清试验对松仁多糖的免疫功能进行测定，结果显示250 mg·kg-1的多糖对小鼠足跖厚度和吞噬指数有显著性增加效果，松仁多糖能够使免疫器官增重，提高机体免疫力。

2.4 抗菌活性

有关多糖抑菌活性的研究，多数集中在植物多糖和微生物多糖上。冯雪［26］采用牛津杯法，测定抑菌圈以考察松塔多糖的抑菌情况，结果显示随多糖浓度增加，抑菌效果越好；对大肠杆菌、青霉的抑制作用较强，抗菌能力是有选择性的；最小抑菌浓度分别为：大肠杆菌0.5 mg·mL-1，青霉0.25 mg·mL-1，酿酒酵母0.25 mg·mL-1；用不同分子量的多糖抑制不同菌种，各菌种间抑制强弱效果不同。在蒙琦［27］的研究中，松塔多糖浓度和对沙门氏菌、大肠杆菌的抑制作用呈正相关，当浓度为0.5% 时即可对沙门氏菌产生抑制效果，各菌种抑制强弱为：沙门氏菌>大肠杆菌>志贺氏菌。

2.5 其他活性

通常，内含硫酸基的多糖具有抗病毒活性，微生物细胞壁具β-1，3 葡聚糖结构，而这种结构属于机体防御诱发基因［28］。多糖通过抑制逆转录酶活性、增强机体免疫等途径，对疱疹病毒、登革热病毒、甲型肝炎病毒等病毒有抑制作用，且对宿主细胞无毒副作用［29］。 此外，红松多糖还具有降血脂［30］、降血糖［31］、抗辐射［32］等多种生物活性。

3 问题与展望

我国红松资源丰富，但松塔、松针等常作为加工副产品丢弃，以至于资源转化率较低。有关多糖的研究是21世纪的热点问题，已有研究证实红松多糖具有多种生物活性，提取方法的差异会导致多糖中单糖组成不同，进而影响生物活性效果。今后可以从红松多糖构象等分子方面进行后续深入探索，为红松资源的合理开发提供多种可行方案。