冰冻人血清α-淀粉酶催化活性浓度候选二级标准物质的研制

王建兵，韩丽乔，林海标，张乔轩，严 君，庄俊华，黄宪章

（广东省中医院检验医学部，广东 广州 510120）

血清、尿液α-淀粉酶测量是临床上最常用的实验室检测指标之一，在胰腺疾病，特别是急性胰腺炎的诊断、疗效观察中具有重要作用。淀粉酶是急性胰腺炎早期诊断指标[1]，为解决临床检验血清淀粉酶测量结果的正确性，实现测量结果的可溯源性和临床检验结果可比、互认，减少重复检查，减轻患者负担，本实验室制备了2个水平的冰冻人血清α-淀粉酶催化活性浓度候选二级标准物质。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

cobas 8000全自动生化分析仪（瑞士罗氏公司）及配套试剂、校准品和质控品，U-3310分光光度计（日本日立公司）。参考方法试剂：N-2-羟基乙基哌嗪-N'-乙基磺酸（批号为017K5410，美国Sigma公司），4，6-亚乙基-4-硝基苯-α-（1-＞4）-D-麦芽七糖（批号为121214A，北京阿匹斯公司）。有证参考物质IRMM/IFCC-456（欧盟参考物质和测量研究中心）。

1.2 标准物质样本制备

选择外观清亮，无脂血、黄疸和溶血的样本。乙型肝炎病毒表面抗原、梅毒螺旋体抗体、丙型肝炎病毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗体检测阴性。经2次除菌过滤后，分装至无菌收集管中，每支1 mL，共300支。制备了2个水平的标准物质，可-70 ℃冰箱保存。

1.3 标准物质评价

按照JJF 1343—2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》和JJF 1644—2017《临床酶学标准物质的研制》要求进行均匀性、稳定性、互换性评价[2-3]，所有样本均采用cobas 8000全自动生化分析仪测量。

1.3.1 均匀性检验 取15支样本，在1个批次内完成测量，每支样本重复测量3次。结果采用单因素方差分析进行评价。方差分析结果中的组间方差MSamong＞组内方差MSwithin时，样本间均匀性的标准偏差sbb计算公式为：

式中ubb，rel为α-淀粉酶由于样本不均匀性引入的不确定度分量。

1.3.2 稳定性评价 采用同步稳定性进行评估，结果采用回归分析的t检验进行评价，基本模型为：Y=β0+β1X，式中β1、β0为回归系数，X为时间，Y为标准物质的特性值。（1）短期稳定性评价。评价运输对标准物质待定特性值的影响。分别于第1、2、3天从冰箱中取出样本，放入干冰冷冻包装箱，与第5天从储存冰箱中取出的样本同时进行测量。每个水平1个监测点抽取2支样本，4个监测点合计8支样本。在1个批次内完成测量，每支样本重复测量3次。（2）长期稳定性评价。评价标准物质-70 ℃保存1年的稳定性。分别于第0、7、31、90、182天从-70 ℃冰箱中取出样本，放入液氮瓶中，与第365天从-70 ℃冰箱中取出的样本同时进行测量。每个水平1个监测点抽取3支样本，共6个监测点，合计18支样本，在1个批次内完成测量，每支样本重复测量3次。（3）使用时稳定性评价。评价标准物质使用时储存于冰箱（2～8 ℃）或室温（20～25 ℃）的稳定性。分别于24、6、4、2 h从-70 ℃冰箱中取出4支样本，冰箱或室温各放置2支，与测量前从-70 ℃冰箱中取出的样本同时进行测量。每个水平1个监测点抽取4支样本，冰箱或室温环境各放置2支，进行稳定性检验，共5个监测点，合计20支样本。在1个批次内完成测量，每支样本重复测量3次。（4）稳定性引入的不确定度。由稳定性引入的不确定度计算公式为：us=s（β1）×X，式中us为由稳定性引入的不确定度，s（β1）为β1的标准偏差，X为给定的保存期限。

1.3.3 互换性评价 互换性采用最小二乘法进行线性回归分析。（1）参比检测系统。实验室参照2006年国际检验医学溯源性联合委员会推荐的α-淀粉酶参考测量程序（37 ℃）[4]建立一级参考方法[5]。（2）临床评价检测系统。系统1：瑞士罗氏公司cobas 8000全自动生化分析仪及配套试剂（AMY384295）、校准品（cfas，lot：305596）和测量程序；系统2：美国贝克曼库尔特公司AU5800全自动生化分析仪及配套试剂（AMY6159）、校准品（lot：F6662）和测量程序；系统3：瑞士罗氏公司cobas 8000全自动生化分析仪、深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司试剂（AMY 142819001）、校准品（059318006）和测量程序；系统4：瑞士罗氏公司cobas 8000全自动生化分析仪、四川迈克生物股份有限公司试剂（AMY0518061）、校准品（Lot：366059）和测量程序。（3）样本。共20份新鲜单供体人血清样本，浓度范围覆盖标准物质浓度范围，每个样本重复测量2次。

1.4 定值

1.4.1 定值方法 定值依据参考文献[4-5]进行（同参比检测系统）。2个水平的标准物质每日分别测量3次，连续测量3 d，共9个测量结果。

1.4.2 定值方式 由6家通过中国合格评定国家认可委员会认可的参考（校准）实验室联合定值。

1.4.3 定值及其引入的不确定度计算 根据测定数据服从正态分布状态，组间数据是否为等精度进行计算[2]。

1.4.4 结果检验 采用Shapiro-Wilk进行正态分布检验，采用格拉布斯（Grubbs）法进行组内可疑值检验和各组数据平均值显著性检验，组间数据等精度检验采用科克伦（Cochran）法。

1.4.5 标准值的不确定度评定 标准物质的合成标准不确定度（uCRM）计算公式为：

式中ubb为由甁间不均匀性引入的标准不确定度，ults为由长期（1年）不稳定性引入的标准不确定度，usts为由短期不稳定性引入的标准不确定度，uchar为由定值引入的标准不确定度。扩展不确定度（UCRM）按照公式：UCRM=合成标准不确定度（uCRM）×κ计算，式中κ为包含因子，此处κ=2（置信水平为95%）。

2 结果

2.1 均匀性单因素方差分析

根据自由度（14，30）及设定的显著性水平（α=0.05），通过F值分布临界值表查到临界Fα=2.04，标准物质的F值分别为1.232（水平1）、1.656（水平2），F＜Fα，显示标准物质具有良好的均匀性。见表1。

表1 α-淀粉酶标准物质均匀性单因素方差分析结果

2.2 稳定性评价结果

均值与时间关系的直线回归方程为直线斜率|β1|＜t0.95，n-2·s（b1），式中n-2为自由度，P=0.95，s（b1）为直线斜率的标准偏差，斜率不显著，未观测到不稳定性，表明在规定的时间内均稳定。见表2。

表2 稳定性评价结果

2.3 互换性评价结果

各系统回归方程的r2＞0.009 5，测量结果位于95%可信区间上、下限内。见表3。

表3 标准物质互换性评价结果

2.4 定值结果和不确定度

采用格拉布斯（Grubbs）法进行组内可疑值检验和各组数据平均值显著性检验，结果显示组内无可疑值。各实验室平均值之间无显著性差异，等精度检验的临界值为0.422 9。其他结果见表4。

表4 α-淀粉酶标准物质定值结果和扩展不确定度

3 讨论

利用冰冻混合人血清研制酶学二级标准物质，甚至一级标准物质，原料无基质效应，均匀性良好，稳定性可靠，但不易购买到。为解决我国同类产品供应不足的问题，本实验室联合其他5家参考实验室，采用联合定值的方法，研制了2个水平的α-淀粉酶冰冻混合人血清候选二级标准物质。联合定值实验室均通过了中国合格评定国家认可委员会依据ISO/IEC 17025和ISO 15195标准的认可，定值使用的方法为国际检验医学溯源性联合委员会推荐的一级参考方法[4]，所得结果直接溯源到国际单位，解决了我国商品化试剂盒校准品长期缺乏溯源性的问题。通过联合定值，避免了单个实验室产生的偏移，定值结果更可靠。

稳定性评估采用同步稳定性评估，将所有样本保存在液氮条件下，在同一时间使用同一检测系统进行检测，避免了检测系统不同时间、不同批号试剂或校准品，甚至仪器不同状态引起的偏移。在测量过程中，测量样本较多，且放置于开口样本杯中，应缩短测量批之间的时间，否则测量结果变异较大。本研究研制的2个水平α-淀粉酶冰冻混合人血清候选二级标准物质的均匀性良好，可至少稳定1年，但与美国国家标准和技术研究所研制的标准物质909c相比，稳定期仍然较短。本实验室将继续监测，以分析标准物质稳定性的更长期限。

本研究采用科克伦（Cochran）法检验各实验室间数据的等精度。选取的显著性水平α不同，其判断标准也不同。若最大方差与所有实验室方差和之比＜α=0.05的科克伦（Cochran）检验临界值C，表明各实验室数据平均值为等精度；若＞α=0.05、＜α=0.01的科克伦（Cochran）检验临界值C，表明该标准物质被检验的最大方差组为歧离值，与各实验室核实并确认测量方法、测量条件及操作过程均无误后，仍按等精度处理；若＞α=0.01的科克伦（Cochran）检验临界值C在经确认测量方法、测量条件及操作过程均无误后，应慎重采用不等精度加权方式处理。

本实验室研制的冰冻混合人血清α-淀粉酶候选二级标准物质均匀性好，稳定性符合预期，具有可溯源性和互换性，对推动酶学检验的标准化进程意义重大。

（致谢：感谢上海市临床检验中心居漪，四川迈克生物科技股份有限公司孙可其，美康生物科技股份有限公司沈敏，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司王英国，北京利德曼生化股份有限公司刘春龙在标准物质研制过程中给与的帮助。）