土田七中化学成分的分离与鉴定

马丽芳，李 燕，陈 凯，汪 伦

(1.四川大学化学工程学院，四川成都610065；2.四川大学 生物治疗国家重点实验室，四川成都610041)

土田七[Stahlianthus involucratus（King ex Bak.）Craib]，别名也叫姜七、三七姜、姜叶三七、竹叶三七，为姜科土田七属植物土田七的块根和根茎。姜科植物是多年生草本植物大家族，种类繁多，是热带和亚热带地区分布最广的植物之一，大约有47属1400种。姜科植物是次生代谢产物的来源，具有丰富的化学结构和重要的生物活性。目前，姜科植物因其植物化学和药理特性被广泛研究，许多姜科植物中分离出多种具有药理作用的活性化合物。

植物土田七，分布于中国的云南、广西、广东、福建等省，在印度也有分布[1]。其味辛、微苦，性温，具有散瘀消肿，活血止血之功效。作为一种民间药，它的根茎长期以来一直用于传统医学中治疗炎症，疼痛和发烧[2]。

根据已有文献报道，目前从土田七中分离得到的化合物包含麦角烷二聚物、倍半萜类、卡丹烷二聚体[3-6]。由于对该植物成分与活性的报道较少，给该药用植物的使用、推广以及鉴定等方面带来较大的困难。为了进一步寻找土田七中化学成分，给土田七的应用奠定物质基础，作者利用半制备型高效液相色谱、柱色谱等多种色谱分离技术对土田七进行分离纯化，并采用质谱和核磁共振波谱鉴定了所得化合物的结构，为土田七的活性研究奠定物质基础。

1 实验部分

1.1 主要仪器与材料

Bruker avance 400型核磁共振仪，德国布鲁克公司；QTOF质谱仪和ESI离子源，英国沃特世公司；旋转蒸发仪，瑞典BUCHIR200；半制备型高效液相色谱，美国沃特斯；Water 2695液相色谱仪，美国Waters公司；中压柱层析系统，瑞士Buchi Flawil公司；MCI-gel CHP 20树脂，日本三菱公司；Sephadex LH-20，美国Amersham P-harmacia Biotech公司；柱层析硅胶，德国默克公司。

药材由四川大学生物治疗国家重点实验室胡以国教授提供，采自云南，并鉴定为土田七[Stahlianthus involucratus（King ex Bak.）Craib]。

1.2 提取与分离

土田七提取流程图如图1所示。土田七根茎2 kg，经粉碎后，采用60目的筛网过筛，用75%乙醇（3 L）加热回流提取，每次提取3 h，提取3次合并提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩得到浸膏412 g。将浸膏用温水（5 L）分散，分别用正己烷（5 L/次）、乙酸乙酯（5 L/次）、正丁醇（5 L/次）3种溶剂进行萃取，每种溶剂萃取3次，将各部分用旋转蒸发仪减压浓缩，得到正己烷部分26 g，乙酸乙酯部分61 g，正丁醇部分146 g。

图1 土田七提取分离流程图Fig.1 Flowchar t for extraction and isolation of Stahlianthus involucratus

将正己烷部分（20 g）用硅胶（60～100目）干法拌样，旋干后进行中压柱层析（100～200目）分离，用石油醚-乙酸乙酯作流动相进行梯度洗脱（1∶0～0∶1，v/v），每250 mL收集1次，通过TLC（薄层色谱法）进行检测，用旋转蒸发仪将洗脱液分别减压回收溶剂，得到6个组分（Fr.P.1～Fr.P.6）。Fr.P.3（2.69 g）采用中压柱层析（200～300目），用石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱（50∶1～0∶1，v/v），每50 mL收集1次，通过TLC进行检测，用旋转蒸发仪将洗脱液分别减压回收溶剂，得到5个组分（Fr.P.3.1～Fr.P.3.5）。进一步对Fr.P.3.1用中压柱层析（200～300目）分离，用石油醚和乙酸乙酯作流动相进行梯度洗脱（50∶1～0∶1，v/v），经TLC检测后得到了4个组分（Fr.P.3.1.1～Fr.P.3.1.4）。Fr.P.3.1.3采用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm），用甲醇和水（95∶5，v/v）进行等度洗脱，得到化合物1。

将乙酸乙酯部分（50 g）用硅胶（60～100目）干法拌样，旋干后进行中压柱层析（100～200目）分离，用石油醚-乙酸乙酯作流动相进行梯度洗脱（1∶0～0∶1，v/v）。通过TLC进行检测，每500 mL收集1次。用旋转蒸发仪将收集的洗脱液分别减压回收溶剂，得到7个组分（Fr.E.1～Fr.E.7）。Fr.E.3（2.3 g）用硅胶（200～300目）干法拌样，旋干后进行中压柱层析（200～300目）分离，用石油醚和乙酸乙酯作流动相进行梯度洗脱（40∶1～0∶1，v/v），每100 mL收集1次，通过TLC进行检测，用旋转蒸发仪将收集的洗脱液分别减压回收溶剂，得到6个组分（Fr.E.3.1～Fr.E.3.6）。Fr.E.3.6用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm），在甲醇和水（80∶20，v/v）的条件下等度洗脱，得到化合物8。Fr.E.4（5.9 g）用Sephadex LH-20柱（填料为Sephadex LH-20，50μm），采用二氯甲烷和甲醇（1∶1，v/v）进行等度洗脱，共得到5个组分（Fr.E.4.1～Fr.E.4.5）。Fr.E.4.3采用SephadexLH-20柱（填料为Sephadex LH-20，50μm），用二氯甲烷和甲醇（1∶1，v/v）进行等度洗脱，得到9个组分（Fr.E.4.3.1～Fr.E.4.3.9）。进一步采用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm）对Fr.E.4.3.1分离，用甲醇和水（60∶40，v/v）进行等度洗脱得到化合物2。Fr.E.4.3.4采用中压柱层析（200～300目），用石油醚和乙酸乙酯作流动相进行梯度洗脱（20∶1～1∶1，v/v），共得到5个组分（Fr.E.4.3.4.1～Fr.E.4.3.4.5）。Fr.E.4.3.4.1用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm），用甲醇和水（60∶40，v/v）作流动相进行等度洗脱，得到化合物4和5。Fr.E.4.3.4.2用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm），用甲醇和水（55∶45，v/v）作流动相进行等度洗脱，得到化合物3。Fr.E.4.3.4.4利用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm），用甲醇和水（50∶50，v/v）作流动相进行等度洗脱，得到化合物7。Fr.E.4.3.6利用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm），用甲醇和水（45∶55，v/v）进行等度洗脱得到化合物6，利用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm）对Fr.E.4.3.7分离，用甲醇和水（45∶55，v/v）进行等度洗脱得到化合物9和10。采用MCI柱（填充材料为MCI-gel CHP 20P，70～150μm）对Fr.E.7（25.6 g）进行分离，用乙醇和水（1∶3，1∶1，3∶1和1∶0，v/v）进行梯度洗脱得到4个组分（Fr.E.7.1～Fr.E.7.4）。将Fr.E.7.3进一步采用乙醇和水（3∶1～1∶0，v/v）做流动相用MCI柱（填充材料为MCI-gel CHP 20P，70～150μm）分离，得到5个组分（Fr.E.7.3.1～Fr.E.7.3.5）。最后采用半制备液相色谱柱（填料为Sunfire C18，5μm，4.6×150 mm）纯化Fr.E.7.3.3，用甲醇和水（35∶65，v/v）进行等度洗脱得到化合物11。

分离纯化所得化合物进一步采用核磁共振波谱鉴定化合物的结构，根据核磁谱图和薄层色谱（TLC）可判定化合物纯度无杂质，纯度较高。

1.3 结构鉴定

化合物1：无定型粉末。ESI-MS（m/z）：413.3705（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CDCl3）：δ：5.35（1H，m，H-6），5.15（1H，dd，J=8.4，H-22），5.02（1H，dd，J=8.4，H-23），3.53（1H，m，H-3），2.30～0.64（43H，m）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）：δ：140.77（C-5），138.32（C-22），129.30（C-23），121.72（C-6），71.81（C-3），56.88（C-14），55.98（C-17），51.25（C-24），50.18（C-9），42.32（C-4），42.23（C-13），40.49（C-20），39.70（C-12），37.27（C-1），36.53（C-10），36.16（C-25），31.89（C-8），31.68（C-2），28.92（C-7），25.41（C-15），24.37（C-16），24.31（C-28），21.22（C-21），21.10（C-11），19.41（C-19），18.99（C-26），12.25（C-18），12.06（C-29）11.87（C-27）。以上数据与文献报道[7]一致，故鉴定化合物1为豆甾醇。

化合物2：无定型粉末。ESI-MS（m/z）：253.0641（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：7.40（1H，d，J=3.6，H-2），6.60（1H，d，J=3.6，H-3），6.38（1H，d，J=3.1，H-2′），6.30（1H，d，J=3.1，H-3′），5.40（1H，s，H-7），4.63（2H，s，H-5），4.51（2H，s，H-5′）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：178.06（C-6），161.82（C-4），154.70（C-4′），152.50（C-1），150.65（C-1′），123.43（C-2），109.51（C-3），108.83（C-2′），107.47（C-3′），97.89（C-7），56.25（C-5），55.98（C-5′）。以上数据与文献报道[8]一致，故鉴定的化合物2为5，5′-二羟甲基糠醛。

化合物3：无定型粉末。ESI-MS（m/z）：257.1025（[M+H]+）。1H NMR（400 Hz，CD3OD）：δ：5.98（1H，q，J=6.8，H-2），5.20（1H，s，H-10），4.86（1H，s，H-10），3.02（2H，s，H-4），1.97（1H，s，CH3-12），1.91（3H，d，J=6.8，CH3-1），1.62（3H，s，CH3-7）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：172.39（C-7），170.04（C-11），169.53（C-8），146.38（C-5），138.64（C-2），130.56（C-3），111.61（C-10），82.98（C-6），35.54（C-4），20.94（C-9），19.84（C-12），14.55（C-1）。命名为顺式-6-甲基-5-亚甲基-3-亚乙基-6-乙酰氧基己二酸。

化合物4：无定型粉末。ESI-MS（m/z）：259.1103（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.06（1H，d，J=7.1，H-2），2.61（1H，m，H-4），2.18（1H，m，H-5），2.10（1H，m，H-4），2.09（3H，s，CH3-11），2.02（3H，d，J=7.1，CH3-1），1.72（3H，s，CH3-9），0.82（3H，d，J=7.2，CH3-12）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：173.02（C-10），170.12（C-7），169.77（C-8），138.28（C-2），130.83（C-3），83.49（C-6），35.61（C-4），32.23（C-5），21.02（C-9），19.93（C-11），14.52（C-1），12.11（C-12）。以上数据与文献报道[9]一致，故鉴定化合物4为反式-（2R，3S）-2，3-二甲基-5-亚乙基-2-乙酰氧基己二酸。

化合物5：无定型粉末。ESI-MS（m/z）：217.0154（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.16（1H，d，J=7.6，H-2），2.57（1H，m，H-4），2.28（1H，m，H-5），2.20（1H，m，H-4），2.01（3H，d，J=7.6，CH3-1），1.39（3H，s，CH3-9），0.92（3H，d，J=6.8，CH3-10）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：174.70（C-7），165.42（C-8），145.06（C-2），122.48（C-3），84.69（C-6），34.47（C-4），32.53（C-5），20.67（C-9），15.12（C-1），12.23（C-10）。以上数据与文献报道[10-11]一致，故鉴定化合物5为反式-（2R，3S）-2，3-二甲基-5-亚乙基-2-羟基己二酸。

化合物6：无定型粉末。ESI-MS（m/z）：125.0541（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.93（1H，s，H-2），6.82（1H，d，J=7.5，H-5），6.68（1H，d，J=7.5，H-4），1.96（3H，s，H-1）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：147.90（C-6），145.38（C-3），126.58（C-1），121.33（C-5），115.09（C-4），113.66（C-2），21.33（C-7）。以上数据与文献报道[12]一致，故鉴定化合物6为2，5-二羟基甲苯。

化合物7：无定型粉末。ESI-MS（m/z）：115.0681（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.99（1H，m，H-2），2.43（1H，m，H-4），2.23（1H，m，H-4），1.67（3H，d，J=6.3，H-5），0.88（3H，d，J=7.1，H-1）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：167.98（C-6），141.03（C-3），124.81（C-2），28.51（C-4），12.66（C-5），12.64（C-1）。以上数据与文献报道[13]一致，故鉴定化合物7为2-乙基-2-丁烯酸。

化合物8：无定型粉末。ESI-MS（m/z）：165.0475（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：7.52（1H，d，J=16，H-7），7.34（2H，d，J=8.5，H-2/6），6.73（1H，d，J=8.5，H-3/5），6.18（1H，d，J=16，H-8）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：169.67（C-9），159.76（C-4），145.25（C-7），129.68（C-2/6），125.85（C-1），115.42（C-3/5），114.40（C-8）。以上数据与文献报道[14]一致，故鉴定化合物8为糠酸。

化合物9：无定型粉末。ESI-MS（m/ z ）：165.0521（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：7.49（2H，d，J=8.5，H-2/6），6.72（1H，d，J=12，H-7），6.65（1H，d，J=8.5，H-3/5），5.66（1H，d，J=12，H-8）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：169.62（C-9），157.98（C-4），142.61（C-7），132.23（C-2/6），126.36（C-1），115.98（C-8），114.37（C-3/5）。以上数据与文献报道[14]一致，故鉴定化合物9为反式-4-羟基肉桂酸。

化合物10：无定型粉末。ESI-MS（m/z）：336.1721（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.16（1H，s，H-2），5.76（1H，q，J=7.2，H-20），5.35（1H，d，J=11.6，H-9），5.26（1H，s，H-7），4.94（1H，s，H-8），4.32（1H，m，H-3），4.14（1H，d，J=11.6，H-9），3.80（1H，m，H-3），3.05（1H，m，H-5），2.48（1H，m，H-6），2.39（1H，m，H-6），2.15（1H，m，H-14），1.75（3H，d，J=7.2，CH3-21），1.72（1H，m，H-14），1.59（1H，m，H-13），1.29（3H，s，CH3-18），0.79（3H，d，J=7.4，CH3-19）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：176.78（C-11），166.78（C-16），135.46（C-20），132.55（C-2），132.39（C-1），130.66（C-15），77.97（C-8），76.80（C-12），73.43（C-7），60.90（C-3），57.94（C-9），52.82（C-5），38.60（C-13），37.95（C-14），33.71（C-6），23.81（C-18），13.89（C-21），9.74（C-19）。以上数据与文献报道[15]一致，故鉴定化合物10为千里光宁碱。

化合物11：无定型粉末。ESI-MS（m/z）：376.1682（[M+H]+）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）：δ：6.07（1H，s，H-2），5.98（1H，q，J=7.2，H-20），5.30（1H，s，H-7），5.21（1H，s，H-19），4.97（1H，s，H-19），4.65（1H，d，J=11.6，H-9），4.99（1H，s，H-8），4.44（1H，d，J=11.6，C-9），4.35（1H，m，H-3），3.86（1H，m，H-3），3.81（1H，m，H-5），3.25（1H，m，H-14），3.07（1H，m，H-5），2.87（1H，m，H-14），2.33（1H，m，H-6），1.98（3H，d，J=7.2，CH3-21），1.82（3H，s，H-23），1.65（3H，s，CH3-18）。13C NMR（101 MHz，CD3OD）：δ：170.24（C-11），169.86（C-22），166.20（C-16），145.45（C-13），137.67（C-20），131.46（C-2），130.76（C-1），130.72（C-15），114.97（C-19），82.65（C-12），77.67（C-8），72.86（C-7），60.35（C-3），58.75（C-9），53.35（C-5），36.73（C-14），33.41（C-6），20.65（C-18），19.81（C-21），14.29（C-23）。以上的数据与文献报道[16]一致，因此鉴定化合物11为乙酰化千里光菲林碱。

2 结果与讨论

化合物3为新化合物，无定型粉末。质谱数据给出[M+Na]+=279.0841，可确定该化合物的分子式为C12H16O6，不饱和度为5。1H NMR谱数据给出3个烯烃氢信号，分别为[δ（H）5.98（1H，d，J=6.8，H-2），5.21（1H，s，H-10），4.86（1H，s，H-10）]，2个亚甲基氢信号[δ（H）3.02（2H，s，H-4）]，9个甲基氢信号[δ（H）1.91（3H，d，H-1），1.62（3H，s，H-9），1.97（3H，s，H-12）]。

13C NMR谱图显示化合物共12个碳，与高分辨数据对应。13C NMR数据给出1个烯烃上的次甲基和亚甲基信号δ（C）138.64（C-2）和111.61（C-10），1个亚甲基信号δ（C）35.54（C-4），3个甲基信号δ（C）20.94（C-12），19.84（C-9），14.55（C-1），3个羰基信号δ（C）172.39（C-7），170.04（C-11），169.53（C-8），2个烯烃季碳信号δ（C）146.38（C-5）和130.56（C-3），1个季碳信号δ（C）82.98（C-6）。

如表1所示，通过结合13C NMR和HSQC数据可以更进一步的确定C-H关系：δH 5.20（1H，s，H-10），4.86（1H，s，H-10）为末端烯烃双氢，1个孤立的亚甲基信号δH 3.02（2H，s，H-4），1个与次甲基耦合的甲基信号δH 1.91（3H，d，J=6.8，CH3-1），2个甲基信号δH 1.97（1H，s，CH3-12）和1.62（3H，s，CH3-9）。

表1 化合物3的核磁数据Tab.1 NMR spectral data of compound 3

如图2所示，根据COSY谱可以推断C-2位烯烃与C-1位甲基具有相关性，在HMBC谱中，4-H和5-C、6-C、3-C、8-C以及10-C、2-C，1-C均相关，2-H和1-C、3-C，4-C、5-C、8-C相关，10-H与5-C、6-C、7-C相关，9-H与7-C、6-C、5-C相关，12-H与11-C相关，根据以上分析可以知道该化合物结构与已知化合物4的骨架相似，可以推测出该化合物的基本碳骨架为―CO―C-（＝CH―CH3）―CH2―C（＝CH2）―C（CH3，CH3COO）―CO―，再结合该化合物的分子式可以推断该化合物结构。

图2 化合物3的2D-NMR耦合信息Fig.2 2D-NMR correlationsof compound 3

根据表1，C-2烯烃质子（1H，d，J=6.8 Hz）可推测C-2和C-3之间的烯烃为Z型。根据以上的分析，可以知道该化合物的结构如图3所示，命名为顺式-6-甲基-5-亚甲基-3-亚乙基-6-乙酰氧基己二酸。

图3 化合物3结构Fig.3 Structureof compound 3

3 结 论

综合运用多种现代色谱分离纯化技术和波谱鉴定技术，从土田七中分离、鉴定出11个化合物，其中化合物3为新化合物顺式-6-甲基-5-亚甲基-3-亚乙基-6-乙酰氧基己二酸，丰富了土田七植物的化学成分研究，为土田七植物的使用和开发提供参考。