蜘蛛香单帖环烯醚类成分及其抗乳腺癌活性

胡萍萍， 胡静娜

(1.宁波市中医院，浙江 宁波 315000；2.宁波市鄞州区第二医院，浙江 宁波 315000)

蜘蛛香，又名马蹄香、土细辛、心叶缬草、养心莲、养血莲、臭药、乌参、猫儿屎、老虎七、香草等，是败酱科缬草属植物蜘蛛香ValerianajatamansiJones.的干燥根茎。其药性辛、微苦，温，主产于中国和印度，药用历史悠久，始载于《本草纲目》，2015年版《中国药典》(一部)也加以收载，具有理气和中、镇静止痛、散寒除湿、活血消肿等功效，可用于脘腹胀痛、呕吐泄泻、小儿疳积、风寒湿痹、脚气水肿、月经不调等疾病的治疗[1-2]。研究表明，蜘蛛香中含有木脂素、挥发油、倍半萜以及环烯醚萜类成分[3-6]。现代药理研究表明蜘蛛香具有镇静、催眠、抗肿瘤等作用[7-10]。为进一步研究蜘蛛香的药效物质，本实验对其二氯甲烷提取物的成分进行了较系统的研究，运用硅胶柱、中压柱、制备型HPLC、反相HPLC等方法分离、纯化得到9个化合物，其中，化合物4首次从该属植物中分离得到，化合物1为首次从该植物中分离得到。

1 材料

Thermo ScientificExactiv 高分辨质谱仪(美国赛默飞科技有限公司)；Bruker Avance DPX600核磁共振仪(德国Bruker公司)；中压色谱仪 C-605-615-635(瑞士BUCHI公司)；半制备型高效液相色谱仪600-2487(美国Waters公司)；Amethyst C18-H制备柱(250 mm×21.2 mm，10 μm，美国赛分科技有限公司)；DAISGEL SP-120-40/60-ODS-RPS中压色谱柱填料(日本DAISO公司)；柱层析及薄层层析用硅胶GF254(青岛海洋化工厂)。其余试剂均为分析纯。

蜘蛛香药材购自贵州省江口县，经浙江中医药大学陈锡林教授鉴定为败酱科缬草属植物蜘蛛香ValerianajatamansiJones.的干燥根茎。

2 提取与分离

蜘蛛香干燥根茎粗粉2 kg，以95%乙醇浸泡48 h后，在室温下进行渗漉提取，渗漉液减压浓缩至无醇味，加水混悬至约1.5 L，再加等体积二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷萃取液，减压回收二氯甲烷，得到深褐色油状二氯甲烷萃取物。将二氯甲烷萃取物进行硅胶柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到11个流分 Fr.1～11。取Fr.3进行中压柱层析分离，以90%甲醇洗脱，所得流分蒸干，9号流分薄层制备分离，20 cm×20 cm制备薄层板，以石油醚-乙酸乙酯(6∶1)上行展开，置254 nm紫外灯下，刮取主条带，以乙酸乙酯洗脱，得化合物1(102 mg)，10号流分以与制备化合物1相同的色谱条件，经薄层制备分离，得化合物2(15 mg)，11～13号共3个流分合并，经薄层制备分离，以石油醚-乙酸乙酯(5∶1)上行展开，得化合物3(46 mg)、4(11.4 mg)；取Fr.4进行中压柱层析分离，以60%甲醇洗脱，19号流分蒸干后，得化合物5(13.8 mg)；取Fr.8进行中压柱层析分离，以75%甲醇洗脱，所得13号流分蒸干，得化合物6(72.7 mg)，所得19号流分蒸干，进行制备型HPLC分离，75%甲醇洗脱得化合物7(111.5 mg)；取Fr.5～6合并进行中压柱层析分离，以50%、70%、90%甲醇洗脱，经HPLC分析，合并相似流分，所得流分蒸干，进行制备型HPLC分离得化合物8(27.1 mg)；以90%甲醇洗脱，所得流分蒸干，9号样品进行制备型HPLC分离，73%甲醇洗脱得化合物9(24.2 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：黄色油状。ESI-MSm/z：423.2[M+H]+，445.2[M + Na]+；C22H30O8。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 6.72(1H, s, H-3), 6.00(1H, d, 12.0, H-1), 5.89(1H, t, H-7), 5.39(1H, d, H-6), 4.75(1H, d, 12.0, H-11a), 4.69(1H, d, 12.0, H-11b), 3.45(1H, d, 12.0, H-9), 3.04(1H, d, 6.0, H-10a), 2.93(1H, d, 6.0, H-10b), 2.25(2H, m, H-2′), 2.19(2H, d, 6.0, H-2″), 2.14(1H, m, H-3′), 2.10(1H, m, H-3″), 1.27(3H, s, 2‴-CH3), 1.00(6H, d, 6.0, 4′,5′-CH3), 0.97(6H, d, 6.0, 4″,5″-CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ: 172.4(C-1″), 170.8(C-1‴), 170.3(C-1′), 148.5(C-3), 140.9(C-5), 118.6(C-6), 108.4(C-4), 92.6(C-1), 83.0(C-7), 64.1(C-8), 60.8(C-11), 47.8(C-10), 43.4(C-2″), 43.0(C-9), 43.0(C-2′), 25.8(C-3″), 25.6(C-3′), 22.3(4″-CH3), 22.3(5″-CH3),22.2(4′-CH3), 22.0(5′-CH3), 20.9(2‴-CH3)。以上数据与文献[11]报道基本一致，故鉴定为valtrate。

化合物2：黄色油状。ESI-MSm/z：409.2[M+H]+，431.2[M + Na]+；C22H32O7。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 6.45(1H, s, H-3), 5.92(1H, d, 6, H-1), 5.54(1H, t, H-7), 5.47(1H, s, H-10a), 5.38(1H, s, H-10b), 4.65(1H, d, 12.0, H-11a), 4.45(1H, d, 12.0, H-11b), 2.95(1H, s, H-9), 2.29(2H, m, H-2′), 2.22(2H, d, 6.0, H-2‴), 2.15(1H, m, H-3′), 2.13(1H, m, H-3‴), 2.08(2H, s, H-6), 2.06(1H, t, 6, H-5), 1.27(3H, s, 2″-CH3), 1.00(6H, 4′,5′-CH3), 0.98(6H, d, 6.0, 4‴,5‴-CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ: 173.0(C-1′), 171.6(C-1‴), 170.5(C-1″), 146.9(C-8), 141.9(C-3), 116.1(C-4), 113.3(C-10), 90.2(C-1), 74.8(C-7), 63.5(C-11), 43.4(C-2′), 43.2(C-2‴), 43.0(C-9), 36.8(C-6), 33.8(C-5), 25.7(C-3′), 25.6(C-3‴), 22.4(4′-CH3), 22.4(5′-CH3), 22.3(4‴-CH3), 22.3(5‴-CH3), 21.3(2″-CH3)。以上数据与文献[12]报道基本一致，故鉴定为desoxidodidrovaltrate。

化合物3：黄色油状。ESI-MSm/z：437.2[M+H]+，459.2[M + Na]+；C23H32O8。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 6.69(s, H-3), 5.97(d,J=10.1 Hz, H-1), 5.86(s, H-7), 5.36(d,J=2.3 Hz, H-6), 4.72(d,J=12.4 Hz, H-11a), 4.66(d,J=12.4 Hz, H-11b), 3.42(d,J=10.1 Hz, H-9), 3.01(d,J=4.7 Hz, H-10a), 2.89(d,J=4.9 Hz, H-10b), 2.22(dd,J=7.2, 3.3 Hz, H-2′), 2.21～2.16(m, H-2‴), 2.17(d,J=7.3 Hz, H-3‴), 2.14～2.08(m, H-4′), 2.10～2.07(m, H-3′), 1.25(s, 2″-CH3), 0.98(s, 5′, 6′-CH3), 0.97(s, 4‴, 5‴-CH3)；13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ: 172.7(2″-CH3), 170.8(C-1′), 170.3(5‴-CH3), 148.5(C-10), 140.9(C-3), 118.6(C-4), 108.4(C-1), 92.6(C-9), 83.1(C-5), 64.2(C-6), 60.8(C-11), 47.9(C-7), 43.4(4‴-CH3), 43.0(C-8), 41.4(C-1″), 32.0(5′-CH3), 29.3(C-4′), 25.6(C-2‴), 22.3(C-1‴), 22.2(C-3‴), 20.9(C-2′), 19.2(C-3′), 11.2(6′-CH3)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故鉴定为1-homovaltratum。

化合物4：淡黄色油状。ESI-MSm/z：411.2[M + H]+，433.2[M+Na]+；C22H34O7。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 6.35(1H, s, H-3), 6.00(1H, d, 6.0, H-1), 5.23(1H, m, H-7), 4.60(1H, d, 12.0, H-11a), 4.40(1H, d, 12.0, H-11b), 2.89(1H, dd, 6.0, 18.0, H-5), 2.24(2H, m, H-2′), 2.21(2H, m, H-2‴), 2.13(1H, m, H-3′), 2.12(1H, m, H-3‴), 2.11(1H, m, H-9), 2.10(1H, m, H-8), 2.04, 1.95(2H, m, H-6), 1.28(3H, s, H-10), 1.07(3H, s, 2″-CH3), 1.00(6H, d, 4′,5′-CH3), 0.98(6H, d, 6.0, 4‴,5‴-CH3);13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:173.0(C-1‴), 171.8(C-1″), 170.6(C-1′), 139.9(C-3), 113.5(C-4), 90.9(C-1), 76.9(C-7), 63.6(C-11), 43.5(C-2‴), 43.4(C-2′), 45.7(C-9), 37.1(C-6), 39.0(C-8), 32.0(C-5), 25.7(C-3′), 25.7(C-3‴), 22.4(4′-CH3), 22.4(4‴-CH3), 22.4(5‴-CH3), 22.3(5′-CH3), 21.1(2″-CH3), 12.8(10-CH3)。以上数据与文献[14]报道基本一致，故鉴定为nardostachin monoacetate。

化合物5：褐绿色粉末。ESI-MSm/z：205.1[M+H]+，227.1[M+Na]+；C12H12O3。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 9.93(s, H-10), 9.20(s, H-1), 7.88(s, H-3), 7.86(d, H-7), 6.60(d, 6.0, H-6), 4.68(s, H-11), 3.65(q, 12.0, H-1′), 1.30(t, 12.0, 2′-CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ: 184.9(C-10), 150.7(C-3), 146.2(C-1), 141.1(C-7), 134.4(C-8), 124.4(C-5), 121.6(C-4), 122.9(C-9), 109.2(C-6), 66.9(C-1′), 66.6(C-11), 15.1(2′-CH3)。以上数据与文献[15]报道基本一致，故鉴定为11-ethoxyviburtinal。

化合物6：无色油状。ESI-MSm/z: 518.2[M+ H]+，540.2[M + Na]+；C24H33ClO10。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 6.92(s, H-3), 6.00(d,J=10.1 Hz, H-1), 5.71(t,J=2.7 Hz, H-6), 5.41(d,J=2.8 Hz, H-7), 4.72(d,J=12.2 Hz, H-11a), 4.60(d,J=12.3 Hz, H-11b), 3.93(d,J=11.3 Hz, H-10a), 3.73(d,J=11.3 Hz, H-10b), 2.94(d,J=14.2 Hz, H-2″b), 2.89(dd,J=10.1, 2.5 Hz, H-9), 2.79(d,J=14.2 Hz, H-2″a), 2.32(d,J=7.3 Hz, H-2′), 2.07～2.01(m, H-3′), 1.99(s, 2″″-CH3), 1.89(s, 2‴-CH3), 1.46(s, 5″-CH3), 1.44(s, 4″-CH3), 0.96(d,J=1.8 Hz, 5′-CH3), 0.95(d,J=1.8 Hz, 4′-CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ: 170.8(C-1‴), 170.8(C-1″″), 170.2(C-1′), 169.1(C-1″), 148.6(C-3), 139.7(C-5), 117.6(C-6), 109.1(C-4), 92.7(C-1), 79.4(C-3″), 82.8(C-7), 80.2(C-8), 60.7(C-11), 44.0(C-2″), 42.7(C-2′), 49.6(C-9), 48.9(C-10), 26.7(5″-CH3), 26.6(4″-CH3), 25.6(C-3′), 22.5(2‴-CH3), 22.4(4′-CH3), 22.4(5′-CH3), 21.1(2″″-CH3)。以上数据与文献[16]报道基本一致，故鉴定为valeriandoid B。

化合物7：无色油状。ESI-MSm/z: 577.2[M+H]+，599.2[M + Na]+；C21H41ClO11。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 6.61(s, H-3), 6.57(d,J=1.7 Hz, H-1), 4.98(dd,J=7.8, 6.1 Hz, H-7), 4.91(d,J=12.4 Hz, H-11b), 4.78(d,J=4.8 Hz, H-2‴), 4.68(d,J=12.4 Hz, H-11a), 3.74(d,J=11.5 Hz, H-10b), 3.68(d,J=11.5 Hz, H-10a), 2.72(d,J=1.6 Hz, H-9), 2.61(dd,J=13.6, 6.1 Hz, H-6b), 2.27(d,J=2.1 Hz, H-2″″b), 2.26(d,J=1.7 Hz, H-2″″a), 2.23(dd,J=7.2, 2.4 Hz, H-2′), 2.09(dd,J=7.2, 2.3 Hz, H-6a), 2.08～2.06(m, H-3′), 2.23(d,J=2.1 Hz, H-3‴), 2.11(s, 2″-CH3), 2.09～2.07(m, H-3″″), 1.00(d,J=3.1 Hz, 4′-CH3), 0.98(d,J=1.1 Hz, 5′-CH3), 0.97(d,J=0.6 Hz, 4‴-CH3), 0.97(d,J=1.1 Hz, 5‴-CH3), 0.97(d,J=1.1 Hz, 5″″-CH3), 0.96(d,J=0.6 Hz, 4″″-CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ: 173.3(C-1″″), 170.8(C-1′), 170.7(C-1″), 170.0(C-1‴), 144.8(C-3), 112.8(C-4), 89.4(C-1), 80.2(C-8), 79.8(C-7), 77.1(C-2‴), 70.2(C-5), 61.9(C-11), 54.1(C-9), 49.8(C-10), 43.1(C-2′), 43.0(C-2″″), 40.7(C-6), 29.9(C-3‴), 25.7(C-3′), 25.6(C-3″″), 22.4(5′-CH3), 22.3(4″″-CH3), 22.3(4′-CH3), 22.3(5″″-CH3), 20.9(2″-CH3), 18.7(4‴-CH3), 17.4(5‴-CH3)。以上数据与文献[17]报道基本一致，故鉴定为volvaltrate B。

化合物8：淡黄色粉末。ESI-MSm/z: 219.1[M+H]+，241.1[M+Na]+；C12H10O4。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 9.96(s, H-10), 9.21(s, H-1), 7.91(s, H-3), 7.90(d,J=3.3 Hz, H-7), 6.64(d,J=3.3 Hz, H-6), 5.29(s, H-11), 2.15(s, 13-CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ: 185.0(C-10), 170.6(C-12), 150.7(C-3), 146.29(C-1), 142.1(C-7), 133.8(C-8), 124.9(C-5), 123.0(C-9), 119.3(C-4), 109.4(C-6), 60.4(C-11), 20.8(13-CH3)。以上数据与文献[15]报道基本一致，故鉴定为baldrinal。

化合物9：无色油状。ESI-MSm/z: 425.2[M+H]+，447.2[M+Na]+；C22H32O8。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ: 6.53(d,J=1.5 Hz, H-3), 5.86(d,J=5.4 Hz, H-1), 4.97(t,J=5.7 Hz, H-7), 4.70(d,J=12.3 Hz, H-13a), 4.48(d,J=12.3 Hz, H-13b), 3.08(d,J=5.0 Hz, H-10a), 3.04～2.93(m, H-5), 2.84(d,J=5.0 Hz, H-10b), 2.73(dd,J=8.4, 5.4 Hz, H-9), 2.24(d,J=7.0 Hz, H-16), 2.24(d,J=7.0 Hz, H-22), 2.23～2.21(m, H-17), 2.22～2.20(m, H-23), 2.21(dd,J=7.1, 5.4 Hz, H-6), 2.07(s, 12-CH3), 0.99(s, 18-CH3), 0.99(s, 24-CH3), 0.98(s, 19-CH3), 0.98(s, 25-CH3)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:173.0(C-15),171.1(C-21),169.8(C-11),142.2(C-3),110.8(C-4), 88.4(C-1), 76.8(C-7), 64.2(C-8), 63.3(C-13), 48.8(C-10), 43.4(C-16), 43.2(C-22), 39.4(C-9), 35.1(C-6), 32.6(C-5), 25.7(C-23), 25.6(C-17), 22.4(25-CH3), 22.4(19-CH3),22.3(24-CH3), 22.3(18-CH3), 21.0(12-CH3)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故鉴定为isodidrovaltratum。

4 细胞毒性筛选

采用MTT法对分离得到化合物进行体外抗人源乳腺癌活性的筛选，以Adriamycin为阳性对照。测试细胞株为人源乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB-231。平行测定3次，测试吸光度值，根据抑制率计算化合物对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)。结果显示，化合物1～4、6对人源三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231有一定的抑制作用，IC50分别为(19.02±0.23)、(23.49±0.19)、(24.76±0.37)、(21.03±0.09)、(26.35±0.24)μmol/L；化合物6、8对人源乳腺癌细胞MCF-7有一定的抑制作用，IC50分别为(35.4±0.42)、(37.39±0.16)μmol/L。

5 讨论

败酱科缬草属植物在北欧等国家一般用于镇静、催眠，亦有粗制剂用于临床，单帖环烯醚类成分被认为是其药效物质。据2020癌症报告统计，全球范围，女性癌症发病率最高的为乳腺癌[18]。本研究表明，缬草属植物蜘蛛香中含有的单帖环烯醚类成分亦具有抗乳腺癌活性，其体内抑制活性及分子作用机制需进一步研究，这将为蜘蛛香药材的合理利用提供科学依据。单帖环烯醚类成分，具有镇静、催眠活性，其脂溶性较强，应易穿过血脑屏障，本研究表明该类成分具有较显著的肿瘤细胞毒活性，其对人源胶质瘤细胞的抑制活性研究应是较好的研究方向，课题组后续拟进行进一步的深入研究。