微小RNA在轻度认知功能障碍诊断中的研究进展

张振华 冯晓东， 李瑞青 白俊敏 常文涛 胡延超

(1河南中医药大学，河南 郑州 450000；2河南中医药大学第一附属医院)

轻度认知功能障碍(MCI)是介于正常老化与痴呆之间的一个临床阶段，主要表现为记忆功能下降，但日常生活能力尚未受到明显影响〔1〕。有关流行病学调查显示，我国65岁以上的老年人中，MCI的患病率为20.8%，进展为阿尔茨海默病(AD)年度转化率为25.7%〔2，3〕；据最新统计显示，我国AD患者超700万，因其所致的社会经济负担总额2015已达到10 842.2亿元人民币(1 677.4亿美元)，预计2030年将达到32 802.6亿元人民币(5 074.9亿美元)〔4〕。但同时也有一部分MCI患者并未向AD转化，而是长期保持稳定状态，甚至随着时间进展恢复到正常状态〔5〕。据《中国痴呆诊疗指南(2017年版)》显示，如果能早期识别MCI，并采取有效的干预措施，可能使AD相关的痴呆发病延迟5年〔6〕。因此，实现MCI的早期诊断尤为重要。目前尚无针对MCI诊断的统一标准。根据《2018中国痴呆与认知障碍诊治指南》〔7〕，当前MCI及其高危人群的筛查主要依据临床检查，如影像学检查及传统认知功能评估；然而多数评估需在专业医疗机构完成且具有主观性，同时个别检查成本较高或存在有创性，因此并不适合大群体的初步筛查〔8〕。

微小RNA是一种内源性的长约22个核苷酸的非编码单链RNA分子〔9〕，在控制神经生长、免疫应答、细胞稳态及衰老方面有重要作用〔10〕。研究发现，微小RNA几乎存在于所有生物体液中，如血液、脑脊液、尿液及唾液中〔11〕，与多种疾病的发生发展密切相关。近期一项关于果蝇记忆形成的研究证实miR-276a、miR-980和let-7在大脑特定区域的记忆形成中起重要作用〔12〕。因此，越来越多的学者将目光转移到微小RNA与MCI的关系上，本文探讨微小RNA在MCI及AD的发病中扮演的重要角色〔13，14〕，对实现MCI的早期诊断有着重要的意义。

1 微小RNA与MCI

现阶段，MCI的病理机制尚不明确，不同亚型之间的变异较大。现有研究发现，脑脊液或血液中β淀粉样蛋白(Aβ)42，总tau蛋白(t-tau)和磷酸化tau蛋白(p-tau)的表达水平出现异常的MCI患者更容易进展为AD型痴呆〔15～17〕，且脑脊液中Aβ42的降低和tau蛋白水平的升高有助于区分稳定型MCI和进展型MCI〔17〕。同时诸多研究表明人体内Aβ42和tau蛋白的表达水平与微小RNA密切相关，如Liu 等〔18〕发现miR-384过表达可抑制淀粉样蛋白前体蛋白(APP)和β-淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE)-1，与Aβ42呈负相关；Tian等〔19〕的动物研究证明对APP/PS1小鼠补充叶酸可上调miR-339-5p并下调BACE-1表达，从而减少APP/PS1小鼠脑内Aβ42的沉积；Smith等〔20〕也发现miR-132/212基因敲除小鼠的tau蛋白代谢出现异常，表现出过度磷酸化；同时miR-15家族的成员也可通过靶向细胞外信号调节激酶(ERK)1来调节tau蛋白磷酸化〔21〕。

2 脑脊液微小RNA与MCI

自Cogswell等〔22〕首次证明AD患者的脑脊液中含有微小RNA，并会随病情进展而不断改变以来，AD等神经退行性病变患者脑脊液中异常表达的微小RNA便引起国内外学者的广泛关注。Zhu等〔23〕对30例MCI患者、26例AD患者及42例正常人脑脊液中的miRNA-210和血管内皮生长因子(miRNA-210的作用靶点之一，并与AD的进展有关)的表达水平进行分析发现，与正常对照组相比，MCI患者脑脊液中的miRNA-210和血管内皮生长因子的表达水平明显下调，并且在AD患者中下调更为显著。这一发现不仅有助于探查MCI和AD的发病机制，而且为实现MCI和AD的早期预防和治疗奠定了研究基础。Müller等〔24〕在早期研究已发现AD患者脑脊液中miR-27a、miR-29a、miR-125b和miR-146a的表达水平与正常对照组相比存在差异的基础上，进一步扩大研究队伍，纳入39例MCI-AD患者，结果发现与无痴呆的对照组相比，MCI-AD患者脑脊液中的miR-146a水平升高，与AD患者相比，miR-27a、miR-125b和miR-146a的表达水平升高，但将样品的性别、年龄、储存方式及离心方案等作为混杂因子进行校正后，各组脑脊液中四种微小RNA的表达差异性丢失。同时，文章还指出由于实验中存在技术差异及受脑脊液中血细胞的影响，在研究脑脊液中微小RNA水平时面临很大的挑战性，提出在后期的实验中需要制定更加标准化的研究方案。

3 血浆微小RNA与MCI

Sheinerman等〔25〕的实验结果首次证明了基于血浆中循环无细胞微小RNA的分析的微创测试对检测MCI和AD及其他神经退行性变疾病的无症状阶段是可行的；该实验通过对MCI患者和正常人血浆中的微小RNA进行检测计算，共筛选出13个有明显差异的微小RNA用于进一步分析；然后对MCI组、AD组及年龄匹配的正常对照组血浆中13个表达差异的微小RNA测定分析得出，当将miR-132家族和miR-134家族分别与miR-491-5p和miR-370联合应用时，可得到较好的诊断敏感度(79%～89%)和特异度(83%～100%)，并且在与正常对照组相比时能有效地区分出MCI和AD。这一研究为实现基于血浆微小RNA进行MCI和AD的早期检测和诊断做出了重大贡献。

Wang等〔26〕对遗忘性轻度认知功能障碍(aMCI)患者、AD及健康人血浆中的miR-107和BACE1 mRNA进行定量分析，结果显示，与正常人相比aMCI及AD患者的miR-107和BACE1 mRNA表达水平有明显的差异，并能以91.9%的准确率、98.3%的敏感性及82.7%的特异性有效区分aMCI和健康人；同时，研究还发现血浆中miR-107的表达水平与脑脊液中miR-107表达水平存在相关性，虽其内在机制尚不清楚，但仍表明血浆中的miR-107能够反映aMCI患者脑内的某些改变，有极大的潜力作为MCI诊断的标志物。随后，在该研究的基础上，Wang等〔27〕使用基于表面的形态测量法(SBM)进一步对aMCI患者的皮质厚度(CT)、皮质表面积(SA)及皮质折叠(LGI)进行检查，发现aMCI患者的前额皮质CT和左上额叶SA与认知正常者相比有所减少，同时与血浆中miR-107和BACE1的表达水平存在明显的相关性。提示miR-107可能是MCI和AD发病机制的核心，并有助于实现MCI的早期诊断。

Kayano等〔28〕对受试者血浆中的微小RNA进行检测，随后采用差异相关分析对20种在MCI患者与健康人相比中具有显著不同的微小RNA进行排序，得出其中两对微小RNA，即hsa-miR-191和hsa-miR-101及hsa-miR-103和hsa-miR-222在两组之间有较好的相关性，且其受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)最高(0.962)。此外，其他两个包含hsa-miR-191和hsa-miR-125b的微小RNA相对的AUC值也大于0.95，通过进一步分析发现hsa-miR-191和hsa-miR-125b在MCI和痴呆进展中起关键作用，可能是MCI的诊断标志物。

刘辰庚等〔29〕在先前研究结果的基础上，选取miR-29c进行临床诊断检测，结果显示当截断值为5.17时，与健康对照组相比，MCI诊断的灵敏度为91.70%、特异度为97.67%、AUC值为0.968；当截断值为4.97时，与血管性痴呆患者相比，MCI诊断的灵敏度为87.07%、特异度为100.00%、AUC值为0.961，且当使用其他不同的截断值将痴呆期AD患者与健康对照组和血管性痴呆患者相比时，可获得更好的诊断敏感度和特异度。该研究表明血浆中miR-29c可作为MCI和AD诊断的生物标志物，进一步推动了血浆微小RNA作为MCI诊断标志物的临床研究。

4 血清微小RNA与MCI

Geekiyanage等〔30〕在团队前期研究结果的基础上进一步比较了与年龄匹配的对照组相比MCI(仅指aMCI)和AD患者血清中5种miRNA(miR-137、miR-181c、miR-9、miR-29a和miR-29b)的浓度，虽然由于纳入研究的样本量较少，无法计算出具体诊断值，但此研究为通过检测血清中微小RNA表达水平进行MCI和AD诊断奠定了前期基础。

Zhang等〔31〕在前期动物实验中，利用miRNA微阵列分析发现在快速老化(SAMP8)小鼠(一种与年龄相关的AD模型鼠)中miR-206、miR-132、miR-193b、miR-130b、miR-20a、miR-296、miR-329的表达明显下调，且与AD的发生发展密切相关；因此为深入探究与AD等衰老相关的认知障碍中微小RNA与MCI的关系，Xie等〔32〕对MCI和正常对照组血清中上述7种微小RNA的表达水平进行检测分析，发现在MCI患者中，血清miR-206和miR-132表现出显著的上调，且与认知功能的下降程度密切相关；同时ROC曲线显示当将miR-206和miR-132相匹配时AUC值最高，敏感度(85.5%)，特异度(98.5%)也高于单独检测。为深入探索血清中miR-206与miR-132差异表达的原因，有研究随后又采用生物学检测，发现脑源性神经营养因子(BDNF)和沉默信息调节因子(SIRT)1是上述两种微小RNA的靶基因，且以往研究已证实BDNF和SIRT1与记忆功能和神经退行性疾病密切相关〔33，34〕，故认为血清中的miR-206和miR-132可能是MCI诊断的有效生物标志物。

既往诸多研究已经表明约有一半的MCI患者会向痴呆〔5〕尤其是AD转化。因此对MCI患者进行长期追踪研究十分重要。Xie等〔35〕通过对506例患有aMCI的患者进行5年随访研究发现，在进展为AD的128例aMCI受试者(27.9%)中，血清中miR-206的表达水平较高，SIRT1的表达水平较低，同时其简易智力状态检查量表(MMSE)和蒙特利尔认知评估(MoCA)量表评分均较低，并与基线时血清中miR-206水平显著相关。提示血清miR-206的较高表达水平可能是aMCI向AD转换的独立预后标志物。

Kumar等〔36〕在患有AD和MCI的患者的血清中鉴定了约6 631种类型的微小RNA，通过与正常对照组的对比分析，选出4种显著上调的微小RNA(miR-455-3p、miR-3613-3p、miR-4674、miR-4668-5p)和表达下调的miR-6722进行二次筛选和验证，发现与先前结果一致，即与对照组相比，血清中miR-455-3p和miR-4668-4p在AD或MCI患者中的表达上调最为显著。此外，研究还发现在AD进展初期即MCI阶段，患者血清中微小RNA的表达水平出现最高变异，这为在MCI阶段进行血清微小RNA检测提供了有效的依据，并有利于实现AD的早期预防和诊断。

综上，虽然多数研究都表明外周来源的微小RNA能以较高的敏感度和特异度区分MCI、AD及认知正常者，但由于各研究间在研究方法上存在较大的异质性，导致难以取得研究成果的一致性，限制了微小RNA向临床应用的转化。同时，由于MCI是一种进行性疾病，不同阶段的外周循环微小RNA可能存在较大差异，使得长期的纵向追踪在探索微小RNA作为MCI诊断标志物的潜力上十分必要。因此，未来需要更高质量的研究，使用经过验证的统一标准来选择受试者，采用标准化的实验室分析，同时进行必要的前瞻性队列研究，以识别在MCI诊断中可靠的外周循环微小RNA，推动其向临床应用转化。