植物病原真菌尖孢镰刀菌检测与定量研究进展

董 超， 方香玲

(草地农业生态系统国家重点实验室， 农业农村部草牧业创新重点实验室， 兰州大学草地农业科技学院， 甘肃 兰州 730020)

尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)是一种土传病原真菌，能引起植物枯萎病和根腐病[1]。该菌能侵染芭蕉科植物如香蕉(Musanana)、蔷薇科植物如草莓(Fragariaananassa)、葫芦科植物如西瓜(Citrulluslanatus)、十字花科植物如甘蓝(Brassicaoleracea)、茄科植物如番茄(Lycopersiconesculentum)和豆科植物如苜蓿(Medicagosativa)等100多种具有重要经济价值的作物[2-3]。尖孢镰刀菌在植株根部维管束中定殖，导致导管堵塞，地上部分枯萎，根表皮产生褐色坏死斑，后期根部腐烂甚至整株植株死亡，严重影响植物的生长发育、产量以及品质[4-8]。尖孢镰刀菌侵染后会造成作物大面积的减产，如会引起西瓜减产20%～30%，严重田块可达50%～60%，甚至绝产；发病香蕉园病株率10%～40%，严重可达90%以上以至香蕉园荒弃；苜蓿被感染后产量下降20%～40%，严重地块下降60%以上[9-12]。

目前关于尖孢镰刀菌的研究主要集中在其对植物生长的影响、致病性相关基因表达、防治方法以及不同植物对尖孢镰刀菌的抗病性和抗病机制等方面[13-16]，对尖孢镰刀菌的定性检测和定量分析是进行这些研究的基础。由于尖孢镰刀菌是土传病原菌，土壤中的尖孢镰刀菌含量与病害的发生和严重程度相关。根际土壤是植物根周围土壤的微域环境，是在理化性质、生物特性上不同于原土体的特殊区域，根际土中尖孢镰刀菌含量更直接关系到病害的发生和严重程度[17]。植物组织内的尖孢镰刀菌含量，与尖孢镰刀菌的侵染程度相关。对植物根组织和土壤中的尖孢镰刀菌进行检测和定量，有助于监测田间病害的发生，从而减小经济损失。本文对培养基菌落平板稀释法、常规PCR以及实时荧光定量PCR等检测和定量尖孢镰刀菌的方法及应用进行总结，以期为农业生产中尖孢镰刀菌检测和定量提供理论依据。

1 培养基菌落平板稀释法

尖孢镰刀菌研究初期是采用培养基菌落平板稀释法进行定性和定量分析的。根据尖孢镰刀菌对营养元素的需求，使用添加抗生素的天然培养基或选择性培养基培养分离，分离出尖孢镰刀菌后进行培养，纯培养后观察其形态特征生长习性以及显微结构，使用稀释平板法对其进行定量。常用的尖孢镰刀菌选择性培养基有马铃薯酒精琼脂培养基(Potato ethanol agar medium,PEA)[18-19]和Komada培养基[20-22]等。PEA培养基是韩宝坤等结合马铃薯蔗糖琼脂培养基(Potato sucrose agar medium,PSA)和酒精琼脂培养基(Ethanol agar medium,EA)，通过降低碳源，寻找新的抑菌物质研制出的尖孢镰刀菌选择性培养基，其优点是制作材料便宜，接种时无需无菌操作[18]。而Komada培养基是使用较为广泛的尖孢镰刀菌选择性培养基，在香蕉、西瓜、芦苇和三七等多种作物枯萎病的研究中均有使用[20-22]。

稀释平板法是定量尖孢镰刀菌十分常用的方法，其优点是能够检测出活菌的数量，培养基成本低且操作简单，已应用于多种植物以及土壤中尖孢镰刀菌的检测[23]。目前已有研究者对尖孢镰刀菌西瓜专化型在根际土和非根际土中的含量进行了稀释平板定量分析，发现单作西瓜根际土中尖孢镰刀菌含量高于根围土[24]。何欣等通过对香蕉枯萎病植株根际土和非根际土中尖孢镰刀菌进行稀释平板定量分析，发现根际土中的尖孢镰刀菌含量与根围土中尖孢镰刀菌含量的比值越大，香蕉枯萎病发病越严重[11]。但由于培养基菌落平板稀释法实验周期较长，效率和灵敏度较低，现多与分子方法结合进行验证实验，例如盛茹媛结合传统方法与分子方法定量检测了草莓根中的尖孢镰刀菌[25]。

2 分子检测定量方法

2.1 常规PCR

自PCR技术问世以来，就因其灵敏、快速和准确等诸多优点被广泛应用于植物病原真菌的检测[26-27]。来自同一物种的分离物序列相同，而物种发育越多样化，序列差异也越大[28-29]，由于核糖体DNA的编码区序列具有保守性，因此分析真菌核糖体DNA的编码区序列是真菌分类鉴定的有效方法[30]。

PCR检测技术多样，根据不同引物的PCR检测技术有ITS-PCR和SCAR-PCR，而在PCR基础上进行改进的技术有PCR-ELISA、巢式PCR和多重PCR等[31]。Amutha等在检测引起洋葱枯萎病病原物时，利用ITS通用引物ITS1进行PCR扩增，扩增产物显示与尖孢镰刀菌100%同源，同时根据其形态特征进行鉴定，鉴定其为尖孢镰刀菌[32]。除根据ITS序列进行PCR测定，还可以使用特定序列扩增。限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)就是通过扩增特定序列来检测尖孢镰刀菌的方法，此方法在短时间内即可检测出植物组织和土壤中的尖孢镰刀菌[33]。而莫贱友等使用两种引物检测发生枯萎病的香蕉根组织，对于分离出的6株菌株，使用ITS特异引物(对尖孢镰刀菌不同专化型菌株扩增出547 bp的片段)和SCAR特异引物(对尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种扩增出252 bp的片段，对尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种扩增出205 bp的片段)进行PCR检测，发现1株为尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种，其余均为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种，说明常规PCR可以根据不同引物检测出不同病原菌[34]。而PCR-RFLP和巢氏PCR可以在侵染初期和潜育期检测出尖孢镰刀菌，对早期诊断具有较大帮助[35]，研究表明PCR-RFLP可以在感病品种接种后3天检测到病原菌，巢式PCR可在接种后5天检测到尖孢镰刀菌[36]。除PCR-RFLP之外，在常规PCR的基础上，还开发了多重PCR检测技术，可在一次PCR反应中同时检测多种目标病原体。现已有研究者设计了针对黄瓜枯萎病病原体的新颖和简化引物对，并开发了可同时检测5个目标病原体的多重PCR分析法，从而能够快速准确地诊断相应的病害[37]；Hyun等开发的PCR检测方法可以鉴定四种隔离的真菌病原体[38]。

常规PCR已经成为诊断和研究尖孢镰刀菌的主要工具。PCR技术较传统的研究方法具备许多优势，例如：无需进行尖孢镰刀菌的培养，可以在复杂混合物中检测单个目标微生物，具有快速、灵敏、特异等特性，但常规PCR不能进行尖孢镰刀菌的定量分析[39]。

2.2 实时荧光定量PCR法

由于目前对病原菌的研究不仅需要定性分析，更需要对其精确定量，实时荧光定量PCR(简称实时PCR)开始应用于植物病原菌的检测和定量中。常规PCR检测方法为终点检测法，因为这种检测方法PCR扩增过了对数期，所以重复性较差[40]。而实时PCR在荧光能量传递的基础上，通过一种可以嵌入双链核酸2层碱基之间的荧光染料，在紫外光的激发下，通过测定PCR反应退火或延伸阶段所掺入荧光染料的荧光强度，实现对整个PCR循环进程的实时监控，可以根据循环数与荧光强度的对应关系对待测物进行精确定量，从而可以准确可靠地定量根组织和土壤中的尖孢镰刀菌[39]。

通过实时PCR分别对天然感染的植物组织和土壤以及人工感染土壤中尖孢镰刀菌进行定量分析[40]发现，人工接种的浓度与检测到的尖孢镰刀菌DNA浓度具有线性关系。此外，由于此试验在多种样品(大豆、西瓜和鹰嘴豆的根和自然感染的土壤等)中仍完成了尖孢镰刀菌的准确定量，说明其改进的实时PCR方法的敏感性不受样品的影响。在使用实时PCR检测和定量黄瓜中尖孢镰刀菌黄瓜专化型的过程中，发现了实时PCR分析的扩增效率、灵敏度和可重复性不受样品中其他微生物DNA的影响[41]。使用实时PCR对人工感染的尖孢镰刀菌土壤和自然发病地块的土壤进行了尖孢镰刀菌定量，检测出田间收集的番茄地土壤中的尖孢镰刀菌含量范围为35～182 pg·g-1干土，并且与田间枯萎病的病情指数呈正相关[42]。

土壤中的生物环境和生化环境的改变都会对尖孢镰刀菌含量产生一定程度的影响。使用实时PCR对连续种植香草超过20年但枯萎病的发病率相差7倍的果园中的尖孢镰刀菌进行定量，结果表明在细菌及真菌丰富的土壤环境中依旧可以准确定量尖孢镰刀菌，发病率高的地块尖孢镰刀菌量是发病率低的地块的1.9倍，说明实时PCR可以在微生物类别复杂的土壤环境中准确地定量尖孢镰刀菌[43]。而Li等人的研究则表明实时PCR可以在AM真菌丰富的土壤环境中对尖孢镰刀菌进行准确地定量，发现根际土中尖孢镰刀菌数量受AM真菌的影响较小，但根中尖孢镰刀菌在接种AM真菌后显著降低且与草莓的病情指数呈正相关关系[44]。除此之外，还有研究者使用实时PCR分析土壤理化性质对尖孢镰刀菌含量的影响，例如使用实时PCR来分析草莓枯萎病样地的土壤中的尖孢镰刀菌含量的过程中发现，使用土壤改良剂后尖孢镰刀菌含量由2 000 CFU·g-1干燥土壤降低到0[45]。使用实时PCR对氮含量不同的西瓜根际土和土体土中的尖孢镰刀菌进行定量分析时，发现了氮素的添加能有效地抑制西瓜根际土中尖孢镰刀菌，使每克土壤尖孢镰刀菌的拷贝数由8.9×105降低到6.6×103个[46]。

对植物组织中的尖孢镰刀菌定量有助于对尖孢镰刀菌在植物体内的作用部位进行研究，并以此来探索其作用机理。有研究者使用优化的实时PCR对香蕉假茎、球茎和根组织中的尖孢镰刀菌进行定量分析，发现他们优化的体系的检测限为0.001 ng DNA[47]。使用实时PCR对不同品种菜豆根系中尖孢镰刀菌进行定量以筛选抗病的菜豆品种，发现该技术对根、茎组织中的尖孢镰刀菌DNA最低检测量为1pg[48]。

常规PCR中，反应结果常受反应物中的一些化合物抑制，因为它们会影响PCR产物的积累，但实时PCR的试验结果并不依赖于产物积累，而是通过早期阶段荧光信号的产生来实现的，因此实时PCR可以在复杂的样品中进行尖孢镰刀菌的定量[49]。

3 其他检测定量方法

3.1 免疫学检测

免疫学检测法主要研究抗原和抗体的特异性反应，是一种出现较早应用广泛的实验技术。先是在医学和动物医学方面广泛应用，而后也被应用于植物病害检测[25]。酶联免疫吸附法(ELISA)是根据抗原抗体特异性反应将待测物与酶连接，通过酶的高效催化作用与底物发生显色反应，从而对受检测物质进行定性定量分析，是最早应用的免疫学检测手段[50]。有研究使用ELISA法定量香蕉根系中的尖孢镰刀菌，证实了使用生物防治剂后香蕉根组织中的尖孢镰刀菌的含量减少[51]。并且，使用ELIST和常规PCR方法鉴定镰刀菌，发现ELISA得出的结果与ITS测序鉴定结果100%一致，说明ELISA检测菌种是一种可靠的方式[52]。但ELISA法需提取血清纯化，不同寄主抗原抗体不同，不能标准化，导致其在检测尖孢镰刀菌方面使用受限。

3.2 基因宏阵列

基因宏阵列，是一种运用于医学上检测基因病变的分子生物学方法，经过改进已有效地运用于人、动物以及植物病原菌的检测。基因宏阵列是将无数个核酸序列探针固定在尼龙纤维膜上，通过与标记了发光物质的产物杂交产生信号的一种检测方法[53]，是目前最适合在一次检测中检测多种病原体的技术[26]。基因宏阵列与实时荧光定量PCR对同样处理的样品进行检测，虽然未能定量出尖孢镰刀菌，但代表杂交信号强弱的灰度值与实时荧光定量PCR的结果正相关，尖孢镰刀菌含量越高，杂交信号越强[46]。因此在分析尖孢镰刀菌变化趋势及病害的严重程度时，基因宏阵列也是一个选择。

4 不同方法的综合运用及其比较

目前关于尖孢镰刀菌的检测和定量多是结合传统和分子生物技术进行的。刘芮池等使用多重PCR对菜地土壤的尖孢镰刀菌进行检测，同时也使用形态学方法对菜地土壤病原菌进行鉴定[54]。除此之外由于香蕉枯萎病病原菌的生理小种较难鉴定，对其尖孢镰刀菌的检测也采用形态学鉴定与PCR相辅相成的方式[55-56]。两种方法结合也用于苜蓿、甘蓝、仙人掌以及它们的种植土壤的尖孢镰刀菌检测[38,58]。形态学鉴定虽耗时费力，但其结果直观，可以与PCR结果相互印证，提高说服力。ELISA和PCR技术结合可以提高检测的灵敏度[52,59]。。常规PCR定性分析，实时荧光定量PCR定量分析被使用在香蕉枯萎病的研究中[47]，常规PCR可以简便地检测出尖孢镰刀菌的存在，得出结果后再使用实时PCR定量可以减少繁杂的操作，节约成本。在研究菠菜枯萎病时，使用实时荧光定量PCR对其尖孢镰刀菌的定量与使用稀释平板法对尖孢镰刀菌定量结果呈显著正相关[60]。采用多种方法检测可以对结果进行验证，得到更加准确的结果。

培养基菌落平板稀释法是经典的检测方法，经过长时间的摸索具有完整的工作方法和普遍性，并且能够检测出活菌的数量，培养基准备成本低，过程简单。但此方法经验性较强，实验周期长，需要进行一定程度的摸索后才能提高效率。但随着分子生物学的发展，PCR技术弥补了其缺点，常规PCR技术检测快速灵敏、准确性高、效率高，尽管不能进行定量分析，但仍然是定性分析的良好选择。而实时荧光定量PCR则可以进行准确地定量分析，具有高效准确、特异性强等优点，是目前进行尖孢镰刀菌检测和定量的最佳选择。并且随着生物技术的快速发展，成本降低后实时PCR将成为大规模检测和定量尖孢镰刀菌的方法。目前已有多种检测技术用于检测尖孢镰刀菌，我们在使用时，可以根据我们的实际需求进行选择。

5 结语与展望

随着生物技术的发展，新的检测技术如生物芯片、全基因组测序等方法在真菌检测领域也有所应用。通过综合运用培养基菌落平板稀释法、常规PCR和实时荧光定量PCR、以及新的技术方法，可对不同植物组织和不同生境土壤中尖孢镰刀菌进行有效地检测和定量，从而为预防病害的发生、流行及其有效防治提供前期依据。