CDK4在骨肉瘤中的研究进展*

张 兵 综述，李大鹏，毛良浩 审校

(江苏大学附属医院脊柱外科，镇江 212001)

骨肉瘤是未成年人常见的原发性高度恶性骨肿瘤[1]，是一种极具侵袭性的恶性肿瘤，目前一般认为起源于间叶组织。骨肉瘤虽然在临床诊治方法方面已取得了很大的进步，包括手术切除、新辅助或辅助化疗和放疗，但转移性或复发性患者5年生存率仅为20%[2]。骨肉瘤的发生和发展可能涉及基因突变、染色体变异和DNA异常甲基化等病理和生理机制，但依然存在许多盲点。

癌症的特性之一是细胞不受节制地增殖和生长，细胞周期机制控制着细胞的增殖。细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)在肿瘤中常过度表达和过度活跃，这是由于各种遗传和表观遗传事件影响了它们的调节途径，导致检查点完整性的丧失，并最终导致不受控制的细胞增殖和恶性转化[3-4]。CDK4是细胞周期依赖性蛋白激酶家族一员，是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是调节细胞周期的核心因子之一。有研究发现，CDK4在乳腺癌[5]、肝癌[6]等多种肿瘤的发生过程中均发生了改变。此外，CDK4在人骨肉瘤细胞和组织中也呈高表达，且与骨肉瘤患者预后不良相关[7]。这些发现提示了CDK4在人骨肉瘤中扮演了重要角色。CDK4的表达异常有可能涉及调节CDK4的因子异常和(或)影响细胞增殖的活性物质表达的变化。现将CDK4在骨肉瘤的作用机制及临床意义的研究进展综述如下。

1 CDK4在调控细胞周期中的作用

CDK是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与了细胞周期的进程。随着细胞周期的进行，各种CDK随着细胞周期的进展而交替发挥作用。CDK调节细胞周期转变，使细胞周期有序地进行。特别是CDK4/6通过控制G1期限制点向S期的过渡，在细胞增殖中具有重要作用。

CDK4通过与细胞周期蛋白D(cyclin D)结合从而调节视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)蛋白磷酸化，促进了细胞由G1期向S期推进[8]。磷酸化后的Rb蛋白与E2F转录因子(E2F transcription factor，E2F)解离，释放出E2F转录因子参与细胞由G1期向S期转换，而未磷酸化的Rb蛋白与E2F转录因子结合并抑制其功能而抑制细胞增殖。cyclin D- CDK4/6活性的增加可促进Rb蛋白磷酸化，促进细胞增殖状态。p16INK4A基因(p16INK4A gene，p16INK4A)是CDK4的负调控因子，p16INK4A缺失上调了CDK4表达，使Rb蛋白磷酸化水平升高，导致细胞周期进程加快[9]。CDK4在调控细胞周期中具有重要作用，通过抑制CDK4在骨肉瘤中活性和(或)表达可以达到抑制骨肉瘤增殖和转移的目的。

2 CDK4在骨肉瘤中的作用机制研究

2.1 骨肉瘤中染色体和基因变异对CDK4的作用

有研究表明，CDK4基因改变可导致CDK4表达的改变，其基因改变涉及染色体和DNA甲基化[10-11]。有学者指出，在骨肉瘤中出现染色体12q13～15区域的扩增，该区域包含2个不同的扩增子，一个在12q15以MDM2为中心；另一个在12q13～14以CDK4为中心，这2个区域在骨肉瘤中经常同时扩增，MDM2和CDK4扩增与这2个基因的高表达水平相关[10,12]。7q22～q34区域与人类染色体带12q13～q15/8q24/22q11～q13同源，包括Mdm2、Cdk4、c-Myc、Pdgf-b基因位点。也有研究表明，CDK4基因是骨肉瘤中染色体7q22～34处频繁增加的靶基因，染色体7q22～34区域的增加促进了CDK4的表达[13]。这些染色体的改变通过扩增CDK4影响正常细胞周期进程，从而促进骨肉瘤增殖和转移，可能有助于进一步了解人类骨肉瘤发生和发展的分子机制，然而CDK4基因表达仍可能受基因组增益以外的机制调控。

CpG岛常处于基因的启动子和外显子区域，与人类基因组编码基因相关，位于基因转录区域CpG的甲基化状态影响基因的表达，对肿瘤的研究意义重大。在基于骨肉瘤的DNA甲基化和基因表达谱的CpG甲基化模式研究中，整合分析差异化基因(DEGs)和差异甲基化基因后发现，MEF2转录因子水平升高，上调了下游靶点CDK4表达[11]。同时CpG异常甲基化也存在于CDK4的抑制因子p16INK4A中，p16INK4A中的CPG岛的甲基化使p16INK4A表达缺失，导致cyclin D-CDK4/6失调[9]。也有研究表明，p16INK4A的表达抑制了Brca1启动子以Rb-E2F依赖方式的CDK4的表达[14]。CDK4的异常扩增也可能是基因突变所致，如Rb基因突变导致CDK4异常扩增[15]。p16INK4A的缺失上调了CDK4表达，促进Rb蛋白磷酸化，加快了G1期到S期细胞周期的进展。这些变化也可能来自包括p16INK4A突变失活、cyclin D过表达和产生无法与p16INK4A相互作用的CDK4突变体等。这些改变通过促进CDK4基因表达，在促进骨肉瘤增殖和转移的发展中可能充当着重要角色。染色体和基因变异在CDK4发挥着关键作用。

2.2 骨肉瘤中非编码RNA对CDK4的作用

在CDK4的表达过程中，其接受特定RNA的调控，可能在肿瘤发生和发展进程中承担着不可或缺的作用。这些调控骨肉瘤细胞中CDK4表达的RNA涉及微小RNA(micro RNA，miRNA)、长非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)等。miRNA是一种非编码单链RNA分子，参与了基因的表达。有研究表明，miRNA-506-3p在骨肉瘤细胞中具有抑癌作用，miRNA-506-3p在骨肉瘤细胞中表达降低，导致Rab-3D表达增加，进而导致CDK4和MMP9(matrix metalloprotein 9,MMP9)表达活性增加，导致肿瘤细胞增殖和转移[16]。也有学者指出，骨肉瘤细胞中过表达miR-590-3p可增加P53和P21表达，抑制增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、cyclin、CDK4表达而抑制肿瘤细胞增殖和迁移[17]。同时也有研究者证实，miR-212[18]及miR-505[19]等可抑制骨肉瘤细胞中CDK4的表达而抑制骨肉瘤的生物学行为。而miR-203a可上调cyclin D1、cyclin B1、CDK1、CDK4的表达，而lncRNA GAS5负调控miR-203a，lncRNA GAS5沉默对MG-63细胞生长和转移的促进作用被miR-203a抑制而逆转[20]。lncRNA FBXL19-AS1通过调控miR-346影响骨肉瘤细胞中CDK4的表达而影响肿瘤的恶性行为能力[21]。miRNA连同其靶基因已被证明是骨肉瘤潜在的治疗性生物标志物[22]。研究骨肉瘤中miRNA对CDK4的作用可能有助于更好地理解骨肉瘤的发生和发展的机制，并为临床治疗骨肉瘤带来新的线索。

2.3 骨肉瘤中细胞因子和激素对CDK4的作用

在骨肉瘤的产生及分化的过程中，细胞内某些蛋白和(或)因子可通过调节CDK4参与调控肿瘤增殖和转移。如丝氨酸蛋白酶抑制剂E2(SerpinE2)，是Serpins家族的成员之一，可抑制丝氨酸蛋白酶，促进肿瘤进展，尤其是在肿瘤转移过程中。SerpinE2在骨肉瘤组织中表达水平升高，特别是在转移期患者的组织中，SerpinE2的高表达导致了骨肉瘤患者的低生存率，SerpinE2的表达与CDK4、cyclin D1在骨肉瘤细胞中表现出正相关，且转染SerpinE2后骨肉瘤细胞对硼替佐米和阿霉素的耐药性增加，SerpinE2在骨肉瘤中的高表达可通过提高CDK4、cyclin D1水平刺激细胞增殖，促进药物耐药性，并导致不良生存[23]。而S100A9表达下调促进p27表达，进而抑制了CDK2、CDK4活性，这种抑制作用导致低磷化Rb蛋白大量积累，通过抑制细胞周期从G1期向S期的转变抑制U2OS人骨肉瘤细胞的增殖[24]。蛋白是生命活动的主要承担者，上述蛋白在骨肉瘤中低表达从而促进CDK4的表达参与了骨肉瘤的增殖和转移的进程，但为何在骨肉瘤中这些蛋白低表达值得更深层次的研究。

在体内有些激素可能参与了骨肉瘤的形成。有学者指出，褪黑素在肺癌中可发挥抗肿瘤作用[25]。相似的研究发现，骨肉瘤的发生和褪黑激素的减少似乎是同时发生的，随后证明褪黑素下调G1期相关的cyclin D1和CDK4，与G(2)/M期相关的cyclin B1和CDK1，增加了细胞周期G0/G1期细胞比例，同时降低了S期和G(2)/M期细胞比例，抑制细胞在体内的增殖和转移[26]。肿瘤的发生和发展需依赖于肿瘤细胞获得维持恶性生长的能力，体内激素是否在其中具有重要的作用，其是否在骨肉瘤中有作用值得后续研究。

3 CDK4在骨肉瘤中的临床意义

3.1 CDK4在骨肉瘤中的诊断意义

确诊和区分骨肉瘤的类型可为下一步治疗提供诊疗意见，为进一步优化治疗方案提供支持。MDM2、CDK4在低分化骨肉瘤中表达有助于支持低分化骨肉瘤的诊断[27-29]。低级别骨肉瘤在放射学和组织学上可与纤维和纤维骨性病变(如纤维瘤病和纤维异常增生)混淆，低级别骨肉瘤中MDM2、CDK4的免疫组织化学表达具有特异性，有助于将其与良性纤维性骨组织病变和良性肿瘤区分开来[27,30]。此外，在低级别骨肉瘤中一些偶尔会分化为高级别骨肉瘤，在组织学上与传统骨肉瘤难以区分，MDM2、CDK4在低分化骨肉瘤和去分化骨肉瘤中经常被扩增，而MDM2、CDK4对那些从低级别骨肉瘤进展而来的高级别骨肉瘤具有灵敏度和特异性，免疫组织化学可能有助于识别这一去分化亚群进行精确的亚分类[31]。此外，有研究发现，CDK4、MDM2的共表达可区分骨肉瘤类型，但其阴性不能排除骨肉瘤[29]。因此，CDK4的免疫组织化学特异性表达为临床医师对骨肉瘤的诊断及分型提供了诊疗意见，也在很大程度上为个体化和精准化治疗提供了治疗依据。然而，仍存在部分CDK4阴性表达的骨肉瘤，这也是临床诊疗面临的困难，需探索其他可能的骨肉瘤标志物与CDK4联合诊断，以提高骨肉瘤筛查率。

3.2 CDK4 抑制药物的研究进展

基于在恶性肿瘤细胞增殖和转移过程CDK4的恶性生物学作用，CDK4抑制药物的研究在不断的探索中。首个CDK4抑制剂——palbociclib已获批用于乳腺癌的治疗，治疗骨肉瘤的CDK4抑制药物也在研发中。如palbociclib和CDK4特异性小干扰RNA抑制CDK4/6-cyclinD-Rb信号通路，抑制骨肉瘤细胞增殖和生长[7]。动力蛋白抑制剂 (Dynasore)[32]和斑蝥酸钠[33]等也已被研究证实可通过直接或间接作用抑制CDK4表达而抑制骨肉瘤的增殖和转移。 这些药物的研究为CDK4抑制药物在骨肉瘤中治疗的可行性提供了支持，为骨肉瘤治疗药物的研究打开了新的方向，同时也为CDK4抑制药物与其他抗肿瘤药物联合应用提供了新的思路。通过联合用药增强抗肿瘤药物的敏感性、降低抗肿瘤药物的不良反应存在巨大的研究价值。但这些药物的研究目前仅局限于临床前的基础研究，尚需得到进一步的临床考证。

4 小结与展望

骨肉瘤的发生和发展是多因素共同作用的结果，在调控骨肉瘤细胞周期进程中CDK4具有核心地位。在骨肉瘤细胞中CDK4的扩增加快了细胞周期G1期到S期转变。CDK4的扩增涉及染色体变异、甲基化、基因突变和细胞因子表达的改变等。但在骨肉瘤中CDK4扩增机制的研究尚未完全成为一个体系。CDK4在骨肉瘤中的高表达差异性为在临床工作中诊断骨肉瘤、分型、治疗及预后提供了依据。CDK4抑制剂已在乳腺癌中应用，在骨肉瘤基础研究中也取得了初步进展。但在临床应用方面缺乏有效的研究。探索在骨肉瘤中CDK4的作用机制，以及CDK4抑制药物的研究、CDK4抑制药物与其他抗骨肉瘤药物联合应用以实现精准化和个体化治疗后续存在较大研究空间及价值。深入研究骨肉瘤中CDK4作用将会为骨肉瘤的精准和个体化诊治提供更多的选择。