乳腺癌驱动基因及其精准治疗研究进展

王 圆，徐方名，许俊德，孙 烨，陈文星，2，陆 茵，2，吴媛媛

(南京中医药大学1.药学院，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，2.江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心，江苏 南京 210023)

世界卫生组织国际癌症研究机构发布的2020年癌症负担数据显示，乳腺癌226万例，超过肺癌，成为全球第一大癌。虽然乳腺癌诊治方面已经不断的改进，但是对于晚期乳腺癌患者，目前治疗方案并不理想。恶性肿瘤细胞的一个重要特点就是在肿瘤组织中，由于基因组的不稳定性，出现了具有不同生物特性的变异细胞群体，这些不同的细胞群体对治疗的敏感程度不同。所以未来理想的治疗方案，需要针对乳腺癌不同发展阶段的基因组信息进行个性化的靶向治疗。

1 驱动突变的定义与识别方法

1.1 驱动突变的类型肿瘤是由基因突变驱动的复杂疾病，随着基因组测序技术的发展，揭示出数目庞大的体细胞突变[1]。当突变以极小的概率发生在关键基因上时，将导致克隆扩增，进而驱动肿瘤的发生发展。这些主要负责形成克隆扩增的基因突变被称为“驱动突变”，赋予了肿瘤细胞生长优势和生存能力。获得优势等位基因突变的细胞能够承载基因组中其他基因的突变，这些其他突变不影响肿瘤细胞的表型，且与肿瘤进展无关，被称为“乘客突变”[2]。

在肿瘤中检测到的突变主要包括单核苷酸变异(single-nucleotide variants，SNVs)和拷贝数变异(copy number alterations，CNVs)，SNVs和CNVs是肿瘤发生发展过程中的重要特征，会引起基因表达差异，并最终导致表型的改变[3]。较为有趣的现象是，这两种变异在同一肿瘤样本中的存在是相互排斥的[4]。

肾透明细胞癌、胶质母细胞瘤、急性髓系白血病和结肠癌多为单核苷酸变异[5]。拷贝数变异在肿瘤驱动基因上发生的频率最高，是最有可能提供适应性优势的变异[1, 6]。卵巢浆液性癌和乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌中发生的多为拷贝数变异[7]。对于拷贝数增加的致癌驱动基因，已有相关潜在药物靶点的研究[1]。此外，染色体结构变异也是驱动突变的一种，染色体易位和倒位由于染色体片段断裂，导致片段所在位置发生改变，驱动了20%左右的癌症发展[5]。

1.2 驱动基因的识别方法驱动突变所在的基因为驱动基因，每种癌症类型平均只有2-6个基因被认为是驱动基因，这说明在肿瘤发生发展过程中驱动突变的数量极少，乘客突变的数量远远超过驱动突变[8]。Kandoth等[8]分析了包括乳腺癌在内的12种癌症突变信息，总共筛选出617 354个体细胞突变，其中有398 750个为错义突变，15 141个插入缺失，表明癌症研究面临的挑战之一在于识别驱动基因。

研究基因功能的实验方法，包括利用基因敲除或基因过表达等正反向遗传学操作技术。这些方法对于阐明单个突变基因的功能极其有用，但是在分析来自大规模癌症基因组的海量候选基因时，存在局限性。针对此问题，研究人员开发出了一套固定流程和算法工具，大大提高了筛选驱动基因的效率与精确程度。

鉴别和发现癌症驱动基因主要包括6个流程：数据筛选,除去因测序和样本导致的误差；工具鉴别，使用多种工具区分乘客突变和驱动突变；离群值调整，减少因突变异质性导致的可信度低的结果；手动筛选，去除假阳性结果；下游分析，对基因表达、蛋白结构和临床相关特征进一步的挖掘与分析；功能验证，使用一些实验手段对筛选出来的基因进行功能学验证[9]。其中，区分乘客突变与驱动突变的工具可以分为基于突变频率、功能影响、结构基因组学、网络通路和数据整合这五大类，例如MutsigCV、OncodriveFM、MSEA、DriverNet 和DriverNet等计算工具[10-11]。

2 驱动基因与肿瘤异质性

肿瘤并非由单一细胞群组成，而是会随着时间逐渐演化出不同的肿瘤亚群，表现出异质性[12]，这种异质性还可被分为瘤内异质和瘤间异质。1976年，Nowell[13]开创性地提出了肿瘤细胞群进化假说，认为肿瘤基因组的不稳定性会导致肿瘤细胞发生进化。在各种内源性和外源性因素的驱动下，肿瘤细胞产生突变，在基因组水平、转录组水平、表观遗传或表型方面表现出差异[14]。

在肿瘤发展过程中，基因组的不稳定性导致体细胞不断产生突变，虽然大部分突变不参与肿瘤细胞的选择过程，对肿瘤的发生发展影响较小，但是会存在小部分驱动型突变，促使肿瘤细胞群发生进化。由于异质性的存在，同一肿瘤在不同的患者身上发生的驱动突变不尽相同，甚至同一肿瘤内并非每个癌细胞都存在相同的驱动突变[15]，导致患者对治疗的敏感性不同，大大增加了治疗的难度[16]。所以找到能够驱动肿瘤进化的突变，对于理解肿瘤的发生发展和促进更有效的个性化医疗有着重要意义。

3 乳腺癌驱动基因

Stephens等[17]对100例原发性乳腺癌患者进行外显子测序，使用CaVEMan和Pindel算法根据单核苷酸突变和拷贝数变异水平，鉴定出了包括AKT1，BRCA1，CDH1，PTEN和TP53等常见驱动基因，此外还发现了MAP3K1，MAP3K13，AKT2和NCOR1等新的乳腺癌驱动基因。研究人员从The cancer genome atlas(TCGA)和Metabric数据库中的222个三阴性乳腺癌样本中，收集了拷贝数和mRNA相关信息，使用ADMIRE算法筛选出138个候选驱动基因，包括已知的MYC、EGFR基因以及新鉴定出的ASAP1、IRF2BP2和CCT5基因，其中CCT5是三阴性乳腺癌细胞中促进增殖的驱动基因[18]。

转移和复发是乳腺癌患者死亡的主要原因。Bertucci等[19]对超过600个转移性乳腺癌样本测序数据进行分析，筛选出TP53、ESR1、GATA3、KMT2C、NCOR1、AKT1、NF1、RIC8A和RB1共9个驱动基因。与三阴性乳腺癌早期阶段相比，三阴性乳腺癌在转移后表现出更高频率的体细胞等位基因功能缺失突变，也就是说乳腺癌转移后具有更高的突变负荷和克隆多样性，这表明患者越早接受治疗才越有可能获得较好的预后，并且不同时期的乳腺癌患者需要有更个性化的靶向治疗手段，不能一概而论。Yates等[20]收集了包括原发灶，远端转移和治疗后局部复发在内的3种时期的样本，对此进行全基因组测序分析，绘制出了乳腺癌从原发部位到远端转移这一过程中的驱动基因进化树，结果表明原发部位的驱动突变与复发部位具有一致性，也能够很好的代表转移初期的基因组特征。但是在对163位患者转移灶进行外显子测序后发现，基因组的转移克隆初期可能类似于原发肿瘤，一旦进入转移晚期，将会发生复杂的基因组突变，转移灶部位的基因图谱与原发肿瘤差异显著。

此外，研究人员发现在乳腺癌的不同发展阶段，驱动突变的类型并不是一成不变的。乳腺癌进化早期，CpG二核苷酸上的胞嘧啶向胸腺嘧啶的转换具有较高的突变频率，是主要驱动突变，可能是因为这一特征在整个生命周期相对稳定，并在在乳腺癌发展后期被其他突变信号所覆盖。APOBEC是人体内具有胞嘧啶脱氨酶活性的蛋白质，由于APOBEC酶活性的突变，导致TpC区域下胞嘧啶向胸腺嘧啶的转换或鸟嘌呤的颠换发生时间极其不稳定，不仅会在早期发生或者晚期发生，甚至不发生突变。

4 乳腺癌靶向治疗的发展及其面临的挑战

精准肿瘤学的概念是指在了解患者肿瘤基因组信息后，以此为依据来指导临床靶向治疗，目前市面上已经有了针对乳腺癌驱动基因的靶向药物，其中包括靶向HER2阳性的曲妥珠单抗，通过靶向抑制PARP途径来阻断BRCA突变的奥拉帕尼，靶向CDK4/6的帕博西林，靶向Her1/2的拉帕替尼和尚处于临床Ⅱ期的PIK3CA靶向抑制剂Alpelisib等众多靶向药物。此外，还有很多潜在的乳腺癌治疗靶点，例如SIRT5、P2X7和TENM4等，为乳腺癌治疗提供了新的策略[21-23]。

原发性乳腺癌患者中，全身治疗旨在杀死从胸部扩散的微小肿瘤病灶，因为手术和放疗一般都会治愈原发病灶。尽管转移克隆的基因组在最开始时可能与原发性肿瘤相似，但是当其转移到临床可检测时，已经进一步发生了大量的基因组变化。所以目前关于肿瘤的精准治疗还存在许多问题：

首先，是否应该对存在远端转移的乳腺癌患者转移灶进行活检来决定干预措施尚且存在争议。因为许多转移位点的取样具有一定的挑战，甚至有促进侵袭的可能性，转移灶在定殖后进一步发生进化，从而获得许多新的体细胞突变和关键驱动基因突变。这表明肿瘤驱动因素可以在肿瘤进化过程中的任何时期发生突变，包括起始、恶化、转移和对治疗产生耐药期间，通过这些突变来实现增殖、侵袭或者产生免疫逃逸等功能，所以肿瘤驱动者的角色是会随着时间和部位的变化而改变。在肿瘤发生过程的一个阶段是驱动基因，在另一个阶段则可能不发挥作用[24]。所以理想情况下的临床试验中，应该能够实时频繁的监测响应治疗过程中肿瘤进化所产生的分子变化，这将需要收集原发部位、转移部位的样本或者血液样本中的核酸或者细胞。已有研究表明，大部分转移性乳腺癌患者愿意对复发性病变进行活检以进行分子谱图分析[25]，这也就为未来的精准靶向治疗提供了可能性。

其次，目前的药物往往缺乏高活性和特异性。例如，大约25%的乳腺癌患者发生PIK3CA突变，该突变被认为是乳腺癌的驱动因素[26]。但是在早期临床试验中，使用非选择性PI3K抑制剂只有4%的应答率[24]。第二代α-选择性PI3K抑制剂在动物模型中更具特异性，并且能产生更好的体内抑制作用，然而事实表明，PIK3CA突变型乳腺癌患者对新型抑制剂对应答率只有6%，并且在PIK3CA野生型肿瘤患者中尚未观察到任何反应。因此，开发出更高效并且具有更高生物活性的靶向药物是至关重要的。

5 总结与展望

对于乳腺癌发生转移的患者，当前的全身治疗主要包括激素疗法、细胞毒化疗和数量有限的靶向制剂，例如HER2抑制剂、激素受体阳性肿瘤使用的mTOR抑制剂[27]。目前，除了HER2靶向制剂外，在转移性乳腺癌中尚未证明基于分子图谱检测的靶向治疗优于标准算法，尚无证据表明它可以改善患者的预后。因此，与传统方法相比，设计治疗性临床试验来评估靶标-药物匹配程度被认为是具有研究意义的。

此外，由于肿瘤的异质性，如果瘤内存在两个关键的克隆，其中一个由PIK3CA突变所驱动，另一个则是FGFR1扩增驱动，那么最适的治疗方案可能就是同时使用PI3K和FGFR1抑制剂的联合治疗。在这种情况下，获得临床实验批准将会受到限制。通常情况下，结合两种或多种药物以产生足够的靶点调节作用，同时毒性可耐受的最佳方法是无法确定的，并且需要进行剂量研究。即使最后确定了适当的药物联合方案并可以有效抑制克隆进化，改善或延迟了耐药性的发作，最终仍可能会出现新的驱动克隆。除了ER、ERBB2、PIK3CA和AKT1外，乳腺癌领域最大的问题是缺乏特征明确的驱动因素。所以重要的是要更深入地研究不稳定性发生率与亚克隆结构复杂性之间的关系，以及某些形式的基因组不稳定性是否与更大程度的肿瘤内异质性有关。迫切需要了解驱动基因组不稳定的机制，以便可以开发出抑制肿瘤多样性、适应性和耐药性的治疗方法。

乳腺癌在转移过程中伴随着大量突变从而导致患者之间的基因组图谱差异很大，甚至比原发性乳腺癌中复杂的突变水平还要明显。绘制这种复杂性进化图谱需要招募大量乳腺癌转移的患者，并整合转录组，表观基因组学和临床研究数据，这是未来精准治疗需要面临的问题。一旦问题被解决，将会极大的推动临床治疗，从而提供有关克隆进化模式，治疗失败机制以及代表新治疗靶点途径的见解。