外泌体介导消化道恶性肿瘤中的免疫异常①

李非凡 张尤历 闵静宇 徐 岷

(江苏大学附属医院消化内科,镇江 212000)

外泌体是一种由磷脂双分子层包裹的微囊泡，含有核酸分子、蛋白质、抗原成分等多种生物活性物质。肿瘤源性外泌体将信息从肿瘤细胞转移至邻近细胞甚至是远处组织或器官,在肿瘤的侵袭、迁移、血管生成及免疫调节等多种生物学行为中发挥重要作用。外泌体可作用于大部分免疫细胞，对免疫细胞起双向调节作用，但在肿瘤微环境中主要发挥免疫抑制作用。研究证明，外泌体参与恶性黑色素瘤、肾癌、非小细胞肺癌等肿瘤抑制性免疫微环境形成，但关于消化道肿瘤的研究较少。消化道肿瘤作为全球发病率最高的恶性肿瘤之一，受到越来越多的关注。本文主要综述外泌体在结直肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等肿瘤微环境中对免疫功能的影响及可能机制，以期为新型免疫治疗药物研发提供参考。

1 外泌体的生物学特征及其与靶细胞的相互作用

外泌体最早被发现于成熟哺乳动物的网织红细胞，1981年,TRAMS等[1]首次将此纳米级囊泡命名为外泌体。其是一种直径为40～100 nm的由磷脂双分子层包裹的圆形或椭圆形微囊泡，CD9、CD63、CD81分子常被作为其表面标志物[2-3]。外泌体中含有核酸分子、蛋白质、抗原成分等多种物质，是细胞间通讯的重要方式[4]。其磷脂双层膜结构可保证其中的生物活性物质更有效地发挥作用。多种哺乳动物细胞可分泌外泌体,包括淋巴细胞、树突状细胞(dendritic cells，DCs)、肿瘤细胞、神经细胞、血细胞等。因此，外泌体存在于多种体液中，包括血液、尿液、唾液、滑膜液、乳汁、羊水、附睾液等[5]。外泌体可通过以下1种或多种机制与靶细胞相互作用:①通过表面分子直接激活细胞内信号通路；②通过与靶细胞膜融合转移细胞内蛋白质或基因；③吞噬及内化作用；④受体介导的内吞作用[6]。吞噬作用或内吞作用所携带的外泌体可被导向溶酶体降解和清除，也可直接进入细胞启动再编程过程。

2 外泌体的免疫调节作用

根据外泌体中内含物及靶细胞上受体的不同，外泌体可发挥不同的免疫调节作用，同时具有免疫刺激作用和免疫抑制作用。

2.1外泌体的免疫刺激作用 外泌体的免疫刺激作用可表现在以下方面。肿瘤源性外泌体上存在MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子、肿瘤相关抗原、共刺激分子等，可激发免疫细胞的抗肿瘤免疫反应[7]。此外，外泌体还可通过增加单核细胞数量、招募自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)细胞、引起巨噬细胞的吞噬作用等机制促进机体抗肿瘤免疫应答[8]。最新研究报道，外泌体作为乙肝疫苗佐剂可增强机体免疫反应[9]。

2.2外泌体的免疫抑制作用 虽然外泌体具有免疫刺激作用，但在肿瘤微环境中，外泌体通常发挥免疫抑制作用。最近研究发现，肿瘤源性外泌体富含免疫抑制性蛋白，包括死亡受体配体，如Fas配体(Fas ligand,FasL)或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)，检查点受体配体，如程序性细胞死亡蛋白-1(programmed death-1,PD-1)，抑制性细胞因子，如IL-10和β转化生长因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、前列腺素E2 (prostaglandin E2,PGE2)及腺苷酸通路的胞外酶(CD39CD73)[10-11]。外泌体上的免疫抑制性蛋白与靶细胞结合发挥免疫抑制作用可:①抑制T细胞增殖和CD8+效应T细胞溶解;②抑制NK细胞抗肿瘤功能;③髓源性抑制细胞和T淋巴细胞分化向抑制表型倾斜，包括骨髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)和调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)。

3 外泌体与消化道恶性肿瘤

研究表明，外泌体可通过多种机制调节免疫细胞及相关细胞因子活性，形成抑制性免疫微环境，介导肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤进展。随着消化道肿瘤全球发病率升高，人们开始关注外泌体在消化道恶性肿瘤中的免疫调控作用。

3.1外泌体与结直肠癌 肿瘤免疫与结直肠癌进展的关系一直都是结直肠癌研究领域的热点问题，近年研究认为外泌体可通过调节多种免疫细胞的生物学活性促进结直肠癌进展。HWANG等[12]用荧光素酶标记结直肠癌干细胞源性外泌体，进一步阐明了结直肠癌干细胞源性的外泌体调节髓源性中性粒细胞免疫活性的机制，即结直肠癌干细胞源性的外泌体通过三磷酸核糖核酸诱导中性粒细胞表达IL-1β，延长中性粒细胞存活时间，从而赋予中性粒细胞生长优势及诱导肿瘤前表型。在患有肿瘤的小鼠中，肿瘤相关性中性粒细胞(tumor-associated neutrophils,TANs)类似于粒样MDSCs(G-MDSCs)，均为多形核Ly6G+/Lv6Clow免疫抑制性细胞，而肿瘤中浸润的中性粒细胞数增加与实体肿瘤患者的恶性表型相关[13]。结直肠癌细胞源性外泌体还可调节单核细胞极化过程。研究表明，单核细胞与外泌体的早期接触(从体外培养的第1天开始)引起IL-10、TNF分泌增加[14]。早期接触或延长接触时间可减少活性氧中间产物分泌，减弱对肿瘤细胞的杀伤作用。YAMADA等[15]研究表明，外泌体与T细胞存在相互作用，外泌体孵化Jurkat细胞数减少，并发现Treg相关基因FoxP3、CTLA-4、LAG3、IL-10、PRF1、GZMB表达上调，并证实结直肠癌细胞源性外泌体通过干扰MAPK、AKT、TGF-β/Smad等信号通路抑制T细胞增殖，引起T细胞表型转变,从而具备Treg特征，显著促进结直肠癌进展。POGGIO等[16]首次报道了外泌体上的PD-L1与T细胞上的PD-1受体结合可抑制引流淋巴结中T细胞肿瘤杀伤效应，并揭示了外泌体PD-L1对结直肠癌进展的作用，课题组先是在MC38细胞中敲除Pd-11和Rab27a基因，结果显示无PD-L1分泌，证实PD-L1在外泌体中被包装。敲除Rab27a或PD-1基因的MC38细胞增殖能力无变化，将以上细胞和未经处理的细胞分别注入小鼠体内，结果显示，注入未经处理细胞的小鼠体内肿瘤迅速生长，而敲除Rab27a或PD-11可减缓肿瘤生长、延长小鼠生存期。

3.2外泌体与胃癌 胃癌细胞外泌体同样可通过调节免疫细胞生物学活性形成局部免疫抑制性肿瘤微环境，从而促进胃癌进展。WU等[17]认为，胃癌源性外泌体通过激活NF-κB信号通路上调巨噬细胞源性IL-6、TNF-α表达，进而促进胃癌细胞生长、迁移、侵袭。另有研究报道，中性粒细胞也具有潜在的免疫抑制活性，表现为通过抑制固有免疫和适应性免疫数促进肿瘤免疫逃逸，如其直接分泌促进肿瘤细胞增殖的蛋白酶和炎症因子，如中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastas，NE)、PGE2和IL-1β，或通过抑制T细胞免疫间接促进肿瘤生长，如诱导一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和精氨酸酶1 (arginase 1,ARG1)抑制T细胞功能、释放趋化因子17 (CCL17)招募Treg[18-19]。WANG等[20]研究发现，肿瘤来源的GM-CSF活化janus通路或转录因子3通路诱导中性粒细胞表达PD-L1，随后与T细胞上的PD-1受体结合，降低T细胞的杀伤能力，最终导致肿瘤体积增大。采用PD-L1抗体阻断PD-1/PD-L1通路，结果出现反转，提示中性粒细胞通过PD-1/PD-L1通路抑制T细胞免疫功能促进胃癌细胞生长。ZHANG等[21]证明外泌体使中性粒细胞转变为N2表型，促进胃癌细胞增殖和迁移，课题组取胃癌源性外泌体与人血中性粒细胞共培养12 h，荧光激活细胞分选结果显示中性粒细胞凋亡受抑制，CD11b、MMP9、VEGF表达上升。Transwell实验结果提示胃癌细胞迁移、增殖能力增强，具体机制是外泌体运输高迁移率蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)与Toll样受体(toll like receptor,TLR4)相互作用活化下游NF-KB通路，引起中性粒细胞自噬，最终促进肿瘤进展。

3.3外泌体与肝癌 肝癌发生发展过程中，免疫抑制是重要机制，研究表明，外泌体参与免疫抑制过程。LIU等[22]探索内质网应激条件下肝细胞源性外泌体与肿瘤免疫逃逸的关系，发现内质网应激相关蛋白(GRP78、ATF6、PERK、IRE1α)在肝癌组织中表达上调，且与肝癌患者的生存率和临床分期呈负相关，进而招募CD68+巨噬细胞，上调巨噬细胞PD-L1表达，进而减少CD8+T细胞数、降低IL-2表达，并通过miR-23a/PTEN/AKT信号通路抑制T细胞杀伤作用。另外，HepG2细胞分泌的外泌体中含有可溶性免疫调节分子，显著抑制淋巴细胞增殖[23]。

肝炎病毒的持续感染是肝癌发生的另一个重要机制，研究发现，肝炎病毒可被组装进外泌体，由外泌体介导肝炎病毒免疫逃逸。FENG等[24]发现外泌体介导甲型肝炎病毒逃避抗体的中和作用。被丙肝病毒感染的Huh7.5.1肝癌细胞通过外泌体运输丙肝病毒，进而感染完好的Huh7.5.1细胞，以此逃避免疫系统的清除作用[25]。DENG等[26]以丙肝病毒为模型，揭示了外泌体在介导丙肝病毒逃避抗体中和过程中的作用，发现病毒膜蛋白可通过外泌体途径释放至细胞外，受syntenin蛋白调控。沉默syntenin对丙肝病毒的复制和产量几乎没有影响，但生理量syntenin的异位表达降低了细胞内E2的数量，同时增加了E2包裹的外泌体分泌量。肝癌细胞和人原代肝细胞内一旦表达syntenin蛋白，所释放的丙肝病毒传染性增强，对E2特异性抗体中和作用的敏感性降低。血清中E2/syntenin水平越高，血清抗体中和能力越低[27]。 CHEN等[28]认为，外泌体介导了自噬引起的持续性丙肝病毒感染，而Rab27a表达降低也会降低被感染细胞RNA和蛋白质表达。

3.4外泌体与胰腺癌 胰腺癌发展过程中，外泌体通过免疫抑制和营造有利于肿瘤转移的微环境促进胰腺癌发展。研究发现M2型巨噬细胞较多出现在肿瘤侵袭边界，且其数量与淋巴结转移呈正相关，而与患者预后呈负相关[29]。巨噬细胞的表型转变与外泌体相关。巨噬细胞有2种表型，分别是M1型和M2型，M1型促进炎症反应，而M2型则抑制炎症反应。WANG等[30]认为，缺氧状态下胰腺癌细胞及其所分泌的外泌体高表达miR-301a-3p，外周血中miR-301a-3p表达与侵袭深度、淋巴结转移、TNM分期、预后相关，进一步研究发现，miR-301a-3p通过激活PTEN/PI3Kγ通路诱导巨噬细胞极化为M2表型,促进癌细胞侵袭、迁移及上皮间质转化，在体内和体外实验都得到了验证。SU等[31]发现，外泌体miR-155或miR-125b-2可重新编码胰腺癌肿瘤微环境中的巨噬细胞表型，使其由M2型转化为M1型。而大多数包括胰腺癌在内的实体肿瘤患者中，肿瘤相关巨噬细胞主要为M2表型，将其重新编程至M1表型将有助于胰腺癌治疗[32]。

此外，DCs在胰腺癌肿瘤微环境中的数量较少，且位于肿瘤边界[33]。而循环MDSCs水平在胰腺癌中升高[34]。CD11b+DCs通过促进MDSCs增殖、抑制CD8+T细胞增殖促进肿瘤进展[35]。BASSO等[36]取胰腺癌细胞源性外泌体与人外周血单核细胞共培养，流式细胞术检测结果显示，CD4+、CD25+T细胞数增加，CD8+T细胞数减少。进一步分析发现，外泌体通过转移与SMAD4相关的差异表达的miRNA和蛋白增加mMDSCs和gMDSCs细胞数，减少DCs数及TNF释放。胰腺癌中DCs失去抗原呈递能力和活化T细胞的能力，导致适应性免疫应答受抑制[37]。因此，胰腺癌细胞外泌体通过调节DCs分化与功能在抑制性免疫微环境形成中起重要作用[38]。

4 展望

外泌体在肿瘤免疫微环境形成过程中发挥重要作用。一方面，其参与肿瘤免疫逃逸，另一方面，其被抗原提呈细胞识别，成为肿瘤抗原的天然来源，因此，可用于制备肿瘤疫苗。但还需解决以下问题：①外泌体分泌的机制尚未阐明。外泌体在手术、放疗、化疗时的分泌增加，控制外泌体释放可能改善治疗效果；②外泌体产生何种效应取决于其内容物，因此，分析其内容物对于其临床应用具有重要意义；③如何调节外泌体促癌作用和抗癌作用平衡是进一步研究的重点[39]。因此,以外泌体为基础的治疗策略尚需进一步研究。