支气管肺泡灌洗液肿瘤标志物检测用于肺癌早期诊断的研究进展

王 莉谷秀娟

(1.延安大学医学院，陕西 延安 716000；2.延安大学附属医院东关分院检验科，陕西 延安 716000)

近年来，肺癌的发病率和病死率呈迅速增长趋势[1]，大多数患者确诊的时候一般都是晚期，预后差，五年生存率为10%~20%[2]，给社会和家庭带来巨大的经济和社会负担。早诊断、早治疗可明显改变肺癌患者的生存率。肺癌的确诊主要依靠组织病理学及病理细胞学检查，但组织标本的获取存在一定的难度[3]，特别是对起源于支气管远端的肺癌，想要获取其病理组织更难。检测肺癌肿瘤标志物是实现肺癌早期诊断的重要途经，利用血液、尿液和唾液等体液进行生物标志物检测已成为一种重要的癌症诊断方法[4]。支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)是通过电子支气管镜向支气管肺泡内反复以无菌0.9%氯化钠注射液灌洗收集的肺表面衬液，生化成分主要由磷脂和蛋白质组成，核酸(DNA、miRNA、mRNA)较少，这些成分的变化反映了机体的病理生理状态，可能含有更高浓度的肺癌分泌蛋白，因此被视为肿瘤标志物的丰富来源[5]。由于肿瘤细胞合成和分泌的物质首先释放到病灶处的支气管肺泡内，所以通过检测BALF中特异性的肿瘤标志物对于肺癌的早期诊断、疾病进展监测、预后等有重要意义。

1 常见的支气管肺泡灌洗液肿瘤标志物

1.1 癌胚抗原

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是Gold等[6]在1965年从结肠癌中提取的一种细胞膜表面的酸性糖蛋白，分子量为(180~200)×103，BALF中正常范围是0~5 ng/mL，通常在胎儿发育过程中产生，在出生前即停止分泌。CEA可介导细胞与细胞外基质间的黏附反应，在肿瘤的发生和侵袭转移过程中起关键作用。作为一种具有人类胚胎抗原决定簇的多糖蛋白复合物，CEA常被用于检测结直肠癌，但是随着浓度的升高，也可以预测小细胞肺癌和非小细胞肺癌[7]，也是最早在临床上应用于诊断肺癌的标志物。肺癌患者BALF中的CEA水平明显高于良性病变者，103例肺癌及非肺癌患者支气管肺泡灌洗液、胸水、血清的CEA测定结果呈支气管肺泡灌洗液CEA>胸水CEA>血清CEA的趋势，提示用支气管肺泡灌洗液检测CEA浓度比通常用胸水及血清测定CEA浓度鉴别诊断肺部疾病更为敏感[8]。有报道称肺癌患者BALF中CEA水平比血清中高出30多倍，这可能由于循环中的CEA经肝脏降解，导致其在BALF中浓度聚集[9]。事实上对于无法经支气管镜确诊的肿瘤患者，测定BALF中的CEA是一种有效的辅助诊断方法[10]。而肺腺癌细胞能直接产生CEA的研究结果，进一步突出了CEA是腺癌的特异性肿瘤标志物[11]。

不同病理类型肿瘤中的CEA水平会有不同，表达水平由高到低依次是:腺癌>小细胞癌>鳞癌。丁娜等[12]检测了3种不同病理分型肺癌BALF中CEA的浓度，结果显示腺癌中的浓度远高于小细胞肺癌和鳞癌中的浓度，提示可将CEA作为肺腺癌病情进展及判定临床分期的指标。丁慧强[13]的研究认为，肺癌组支气管肺泡液中CEA的诊断临界点为7.9 ng/mL，此时的敏感性和特异性能达到90%和86.7%。但是需要注意的是，CEA在多种肿瘤组织中如宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌等均会出现异常升高，所以其对肺癌诊断的特异度较低，实际应用中需和其他指标联合检测。

1.2 糖类抗原125

糖类抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)也被称为粘蛋白16或MUC16，在人中由MUC16基因编码，最早是Bast等[14]通过浆液上皮性卵巢癌细胞系OVCA433生产出单克隆抗体OC125，该抗体所特异识别的抗原即是CA125。CA125是在胚胎发育期由体腔上皮细胞产生的一类高分子糖蛋白抗原，与许多肿瘤的发生发展密切相关，属于混合型肿瘤标志物。CA125在细胞内合成并储存，因被细胞间连接和基底膜阻挡而无法入血，故正常人血清中浓度很低，健康人群的含量≤35 U/mL，当组织发生病变时释放入血而升高[15]。

由于CA125在体液中的半衰期仅为4.8 d左右，且代谢快。因此，其水平的变化可以很好的反应肿瘤组织的近期状态。Li等[16]研究表明肺癌组织中有CA125的表达，以肺腺癌中最高，其表达水平与肿瘤的分化程度密切相关。Cedrés等[17]研究发现，在277例Ⅲ~Ⅳ期NSCLC患者中有46.6%的患者血清CA-125水平升高，且其无进展生存期(PFS)更差(4.6月vs7.5月，P<0.05；8.7月vs14.0月，P<0.05)，多因素分析也显示CA125水平升高与预后差有明确相关性。但是对于女性肺癌患者而言，在评估CA125的临床意义时要考虑其激素状况，因为正常的卵巢活动会影响CA125的水平。此外，子宫内膜异位症和妊娠也会提升CA125的水平。Ghosh等[18]研究认为，支气管肺泡灌洗液中CA125的诊断临界点为36.5 U/mL，此时的灵敏度为89.13%，特异度为75%，阳性预测值为80.39%，阴性预测值为85.71%。

1.3 神经元特异性烯醇化酶

神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)是一种糖酵解烯醇酶，分子量为78×103，催化2-磷酸甘油酸裂解生成烯醇式丙酮酸，由α、β、γ三种亚基以二聚体的形式组成αα、ββ、γγ、αγ、βγ五种形式的同工酶，是糖酵解途径中甘油分解的最后环节的酶，优先表达于神经和内分泌组织。因此，NSE可以作为神经元发育成熟的标志，其含量能反映神经元分化的程度[19]。小细胞肺癌属于神经内分泌起源肿瘤，具有神经内分泌细胞和APUD(amine precursor uptake and decarboxylation)细胞的特征。因此NSE是小细胞肺癌最敏感、最特异的肿瘤标志物[20]，其对小细胞肺癌的诊断特异性为40%~70%[21]，对于明确小细胞肺癌的临床分期、鉴别诊断和疾病进展有指导作用。

Carney等[22]首次报道了94例新诊断的和未经治疗的SCLC患者血清NSE水平会升高，且NSE水平与化疗的临床反应之间有很好的相关性。NSE水平高的小细胞肺癌患者术后的生存率低，复发风险也较高。研究表明，NSE是预测小细胞肺癌患者预后的最有效因子，其敏感性优于肿瘤分期、患者临床表现、年龄、性别、CEA和碱性磷酸酶[23]。有研究表明NSE的诊断阈值为2.06 ng/mL，其敏感性和特异性分别为72.0%和69.2%，提示NSE可以作为肺癌恶性程度的指示指标[24]。

1.4 鳞状上皮细胞癌抗原

鳞状上皮细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag)是一种细胞骨架蛋白，分子量为48×103，由1170个核苷酸组成，编码390个氨基酸，属于丝氨酸蛋白酶抑制物家族。BALF中正常范围是0.8 ng/mL，由于SCC-Ag最初是在子宫癌中发现的，所以早期的研究主要集中于子宫鳞状细胞癌。

SCC作为鳞癌细胞的一种特殊蛋白质，在肺癌患者中SCC-Ag的阳性率依次为鳞癌、腺癌、SCLC，并且假阳性率低[25]。罗玲等[26]的检测结果显示肺癌组的SCC-Ag水平明显高于肺部良性病变组，在肺癌Ⅲ~Ⅳ均高于Ⅰ~Ⅱ期，差异有统计学意义，提示SCC-Ag有助于肺癌病理类型的判断，并能间接反映患者的病情进展情况。王磊[27]的研究表明，BALF中SCC-Ag水平高于血清，提示BALF中SCCAg对诊断肺鳞状细胞癌参考价值优于血清，且随着BALF中SCC-Ag的水平升高，临床分期越高。有研究显示肺癌组BALF中SCC的总阳性率可达到95.8%，敏感性为95.8%，特异性为54.3%[28]。

1.5 细胞角蛋白19片段

细胞角蛋白19(cytokeratin，CK19)为主要表达于单层上皮细胞的I型角蛋白，细胞角蛋白19片段(cytokeratin-19-fragment antigen 21-1，CYFRA21-1)是水溶性CK19片段，广泛分布于正常组织表面如复层上皮和鳞状上皮。CK19是一种结构蛋白，属于酸性多肽之一，肿瘤细胞凋亡引起蛋白酶大量激活，导致角蛋白19的某些片段降解并被识别，该片段即为可溶性细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)[29]。CYFRA21-1的分子量为(40~68)×103，主要存在于肺癌、食道癌等上皮起源的肿瘤细胞的胞浆中，其诊断肺癌的灵敏度随着疾病的不同发展阶段而不同，最高可达到69.6%[30]。

BALF中CYFRA21-1的正常范围是0~2.08 ng/mL，Pujol等[31]首次在165名肺癌患者中检测了CYFRA21-1的水平，发现灵敏度和特异度分别是52%和87%，敏感性在鳞状细胞癌中最高，在SCLC中最低。CYFRA21-1的水平变化能反映非小细胞肺癌的病情波动，当肺部存在不清晰圆形焦点，而CYFRA21-1水平又大于30 ng/mL时，提示很可能是原发性支气管肺癌[32]。杨国彪等[33]人的检测结果表明肺癌组患者血清和BLAF中CYFRA21-1水平均高于肺良性病变组(P<0.05)，表明CYFRA21-1水平的变化与肺癌的发生发展有一定的关系。也有研究称CYFRA21-1在鳞状细胞癌患者中的表达高于腺癌和SCLC患者，提示CYFRA21-1可以作为诊断鳞状细胞癌的有效标志物[16]。邬勇坚等[28]测定BALF中CYFRA21-1阳性率为83.3%，敏感性为38.3%，特异度为51.4%。

1.6 胃泌素释放肽前体

胃泌素释放肽(pro-gastrin-releasing peptide，GRP)最初是从猪胃黏膜中分离的，属于胃肠激素，广泛分布于哺乳动物的神经系统、胃肠道和呼吸道。GRP是参与肿瘤细胞生长的重要因子，其通过肿瘤细胞的自分泌或细胞间的旁分泌发挥作用[34]。但GRP的半衰期很短，只有2 min，不稳定，难以检测。而其前体pro-GRP的水平比GRP高400倍，因此通常检测GRP的前体pro-GRP来反映其水平。pro-GRP在肺部良性病变和上皮来源的肿瘤中呈低水平表达，在BALF中的正常范围是28.30~74.40 pg/mL，但在SCLC细胞系和SCLC组织中均高表达[35]，有助于SCLC的诊断。王艳海等[36]研究表明pro-GRP对SCLC的灵敏度和特异度可达到77.2%和91.1%，优于NSE和CYFRA21-1，但是pro-GRP的表达水平与肿瘤的临床分期无明显相关性。

2 BALF肿瘤标志物的临床应用

尽管已经发现了很多与肺癌密切相关的标志物，但是还没有一种标志物是肺癌的特异性抗原。由于肺癌的多态性及复杂性，肿瘤细胞组织来源不同，各项肿瘤标志物单独检测具有一定的局限性，单一指标检测往往难有理想的灵敏度和特异度。高浓度标志物往往预示着患者很可能是肺癌，而不是肺部良性病变，容易导致误诊或漏诊的发生，因此在实际临床应用中多开展联合检测。

一种是多项指标联合检测。有研究者回顾分析了655例肺癌患者和237例肺良性疾病患者CEA和CYFRA21-1浓度对区分原发性肺癌和肺良性疾病的诊断价值，结果显示单用两个指标诊断肺癌的敏感性和特异性分别是69%和68%、43%和89%，而两个指标联合诊断的是95%和33%，特异性大大提高[37]。CEA、CA199与CA125联合检测肺癌的灵敏度与特异度能达到72%和83.5%，均高于单一检测，可使早期肺癌检出率得到明显提高[38]。

另一种是将BALF和血清两种组织联合检测。Cremades等[39]将BALF和血清CYFRA21-1水平联合检测可使肺癌诊断的灵敏度由36%提高到69%。邓丽平等[40]研究发现，单一检测BLAF或血清中的CEA、CYFRA21-1、NSE对肺癌的特异性尚可，但敏感性均偏低，假阴性较多，易造成漏诊，若联合BALF和血清可使诊断肺癌的敏感性和准确率提高，优于单独进行BALF或血清的肿瘤标志物检测。

3 展望

支气管肺泡灌洗术(bronchoalveolar Lavage，BAL)作为依托纤维支气管镜而发展起来的新技术，是诊断间质性肺疾病的基础技术，也是临床上被逐渐广泛应用的新方法。通过BAL可取得BALF，在某种程度上被喻为“液相活检”[41]。肺癌的早发现、早诊断、早治疗是改善肺癌患者预后、延缓病死率的有效手段[42]。肿瘤标志物是癌细胞在肿瘤发生、发展、侵袭和转移过程中分泌的一些活性物质，存在于血液、痰液等体液中[43]。肿瘤标志物在疾病的筛查、诊断、监测进展、复发和预后方面都有重要作用。有研究认为，从肿瘤所在位置获取检测肿瘤标志物的标本优于血液标本，肺癌作为生长在支气管粘膜或肺泡组织上的恶性肿瘤，脱落的肿瘤细胞及其代谢产物可直接进入肺泡腔内，对BALF中的肿瘤标志物进行检测较其它标本更有特异性。在肿瘤早期血清中标志物含量较低，不易检测，而BALF是取自病变部位的支气管肺泡内，浓度较高，能提前预警异常指标，更有助于肺癌的早期诊断，并且对患者机体的损伤也较小。因此，通过对电子纤维支气管镜获取的肺泡灌洗液进行肿瘤标志物的检测，有望成为临床上肺癌早期诊断的重要途经。同时，检测BALF中的肿瘤标志物水平对预测肿瘤患者有无转移、肺部疾病的良恶性鉴别也具有较高的临床价值[44]。但也有研究指出通过检测BALF中肿瘤标志物来进行肺癌诊断的特异或敏感性很低，无法区分良、恶性病变[45]。BALF中肿瘤标志物浓度会受到肿瘤细胞的大小和数目、肿瘤细胞自身产生肿瘤标志物的速度、肿瘤标志物在体内降解和排泄的速度及体液稀释等因素影响。因此，如何规范支气管肺泡灌洗液的取材和处理流程，提升支气管肺泡灌洗液肿瘤标志物检测的诊断价值，同时，在不同组合检测方案中，如何确保既能提高灵敏度又能提升特异度，是今后一个重要的研究方向。