LncRNA 调控细胞自噬的分子机制及在神经系统疾病中的研究进展

李发靖陈 鹏杨仁华陈德云杨 媛何 波沈志强

(昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室,昆明 650500)

长链非编码 RNA (long non-coding RNA,LncRNA)是一种数量庞大而多样化的RNA 分子,其异常表达或功能失调可导致多种疾病的发生和发展,包括肿瘤、自身免疫性疾病和神经系统疾病等[1]。自噬作为细胞的一种自我保护机制,可通过清除错误折叠蛋白或受损的细胞器来维持细胞自身稳态[2]。近年来研究证实,在脑卒中、帕金森病和阿尔兹海默症等多种神经系统疾病中,LncRNA通过影响细胞自噬发挥作用[3],然而具体的调控机制却未见系统报道,因此,总结LncRNA 调控细胞自噬的分子机制及在神经系统疾病中的作用,可能是研究神经系统疾病的病理发病机制和发现药物潜在治疗靶点的重要方向和内容。本文综述了最新的LncRNA 调控细胞自噬的分子机制,阐述了LncRNA 在神经系统疾病中的作用,为将深入理解LncRNA 在神经系统疾病中的作用及其分子机制提供了理论依据。

1 长链非编码RNA

LncRNA 是一类非编码RNA,其长度超过200个核苷酸,广泛分布于哺乳动物细胞中[4]。既往研究发现,LncRNA 在自身免疫性疾病、肿瘤、心血管和神经系统疾病等多种疾病的发生发展中起着重要的作用。虽然LncRNAs 与编码蛋白质的mRNA在序列上存在重合区域,但其保守性较差,表达量也较低[5]。根据LncRNA 与蛋白编码基因的位置关系或功能不同, LncRNA 可被分为以下几类:(1)正义LncRNA,LncRNA 序列与蛋白编码基因重叠;(2)反义LncRNA,LncRNA 序列源于转录互补链;(3)内含子LncRNA,LncRNA 序列来源于转录物的内含子,可能是mRNA 前体的加工产物或真正独立的转录物;(4)双向非编码LncRNA,源于双向蛋白编码基因的转录;(5)基因间LncRNA,LncRNA 序列位于蛋白编码基因之间,但不与蛋白编码基因重叠[6-7]。根据LncRNA 的作用方式,也可将LncRNA 分为以下几类:(1) 信号LncRNAs,接受细胞信号以及其他刺激, 从而影响下游信号的表达; (2) 引导LncRNAs,将酶活性或调节蛋白直接导入基因组中的适当位置,从而引起基因的表达式的改变;(3)诱饵LncRNAs,可作为分子库,限制调节因子的可用性并调节基因表达;(4)支架LncRNAs,为调节因子和酶复合物提供了一个短暂的组装平台[8-9]。

研究发现,LncRNA 主要通过以下几个途径参与调控基因的表达:(1)转录水平上,LncRNAs 通过引导转录因子到目标基因的启动子区域以调节其转录,并且作为转录激活剂或抑制因子介导基因转录;(2)转录后水平,LncRNAs 调节负责生物功能的基因的表达通过调节mRNA 的稳定性、翻译和降解[10];(3)通过对翻译水平的调控,LncRNA 可以通过辅助mRNA 翻译或抑制翻译进行翻译调控;(4)LncRNA 对表观遗传水平的调控,包括 LncRNA 对DNA 甲基化、 组蛋白及微小 RNA (microRNA,miRNA)修饰的影响,以及LncRNA 与染色体修饰复合物相互作用引起染色体重塑。有研究证据表明LncRNA 的异常表达参与到神经系统性疾病的发生和发展过程中[11]。

2 LncRNA 与细胞自噬

2.1 细胞自噬

细胞自噬(autophagy)是一个将细胞质成分包裹在双膜囊泡中,运送到溶酶体进行降解的过程[12]。当机体受到各种环境压力(如营养剥夺和缺氧)、化学和物理损伤时,可通过自噬来维持细胞稳态[13-14]。自噬的整个过程包括如下几个连续的步骤[15]:首先,自噬起始于unc-51 样激酶(unc-51-like kinase, ULK)复合物的诱导,该复合物主要由ULK1/2、200 ×103质量的粘着斑激酶家族相互作用蛋白(focal adhesion kinase family interacting protein with a 200×103mass, FIP200)、ATG101、ATG13 组成。其次,由磷脂酰肌醇3-激酶空泡蛋白分选34(phosphatidylinositol 3-kinase vacuolar protein sorting 34, VPS34)和 VPS15、ATG14、Beclin-1 组成磷脂酰肌醇-3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)复合物,PI3K 复合物的激活有助于囊泡成核,形成自噬 体[16]。然 后 在 LC3-II - 磷 脂 酰 乙 醇 胺(phosphatidylethanolamine, PE) 和 ATG12-ATG5-ATG16 复合物两个泛素化样蛋白系统的相互协作下进行囊泡延伸[17]。其中,ATG12-ATG5-ATG16 复合物表现出E3 连接酶样活性,有助于LC3 与PE 结合反应的刺激和定位。ATG4 能促使LC3 脱羟基生成 LC-I,LC-I 通过 E1 样酶 ATG7 和 E2 样酶 ATG3催化两种连续泛素化样反应方式与PE 结合形成LC-II。LC-II 主要位于自噬体膜上,其表达的增加常作为自噬体形成的标志,因而通常将形成的LCII/LC-I 比值作为自噬体形成的标志[18]。自噬体成熟后与溶酶体小室融合形成自噬溶酶体,可将自噬体内变性的蛋白质和受损的细胞器降解。在降解过程中产生的氨基酸等小分子物质既可为细胞提供能量、营养,也可为细胞的新陈代谢提供原料。p62 蛋白可通过与LC3 相互作用,并在自噬溶酶体系统中持续降解。当自噬不足时,p62 蛋白可在细胞中积累,进一步抑制自噬[19]。

2.2 LncRNAs 调控细胞自噬

细胞自噬可受多种因素调控,包括非编码RNA(如 miRNA 和 LncRNA)转录因子。近年来研究表明,LncRNA 可通过对miRNA 及相关靶基因进行调控,影响细胞自噬的进程[20]。我们可以根据其作用方式的不同,将LncRNA 对自噬的调控方式分为:通过LncRNA-miRNA 轴调控细胞自噬以及LncRNA通过其他途径靶向调控细胞自噬。

2.2.1 LncRNA-miRNA 轴与自噬

近年来研究发现,LncRNA 可通过 LncRNA-miRNA 轴调控细胞自噬。由于miRNA 被认为是在转录后水平控制基因表达中起到关键作用,因而其作为mRNA 基因表达或裂解的抑制因子而被广泛研究[21]。在细胞自噬的调控过程中,miRNA 可以与自噬相关基因(autophagy-related genes, ATG)和其他参与自噬调节的基因的mRNA 靶向结合而形成自噬基因表达的关键介质[22]。有研究证实,miR-30a 的下调可通过促进Beclin1/Atg6 的mRNA 和蛋白质的表达从而促进 Beclin1 介导的细胞自噬[23-24]。也有研究表明,miR-126 通过靶向 3′-UTR使mTOR 基因沉默[25];增强miR-101 可抑制mTOR的表达并促进自噬的进程[26]。

随着深入的研究,研究者通过LncRNA 生物信息学技术,研究了LncRNA 的分子作用方式及其分子机制,发现并证实LncRNA 序列上可有miRNA 识别元件(miRNA recognition elements, MREs)[27],提示LncRNA 可通过 MREs 对 miRNA 进行直接转录调控。现阶段认为LncRNA-miRNA 轴主要通过以下三种方式进行调控:作为竞争性内源性 RNA(competitive endogenous RNAs, ceRNAs)、与 miRNA竞争 mRNA 的结合位点或者表达生成 miRNAs。(1)LncRNAs 与 mRNA 竞争 miRNA 的结合,充当ceRNAs 作为miRNA 诱饵或海绵,在转录后水平抑制靶基因[28]。有研究发现LncRNA 肝细胞核因子1 alpha 反 义 链 1 (hepatocyte nuclear factor1alphaantisense1, HNF1A-AS1) 可 充 当 miR-30b-3p 的ceRNA,通过抑制 miRNA-30b-3p 的表达,导致其靶基因 PIK3CD 的表达下调[29]。Xie 等[30]发现LncRNAX 染色体失活特异转录物(long non-coding RNA X-inactive specific transcript, LncRNA XIST)可充当miR-29b 的竞争性内源性RNA,增加高迁移率族蛋白-1 的表达,从而使肝星状细胞活化和自噬增强;(2) LncRNA 与miRNA 竞争与mRNA 的结合发挥调控作用[31]。有研究证明,LncN-ras 功能 RNA(Lnc N-ras functional RNA, ncNRFR)可与类似let-7 家族的miRNA 结合,从而抑制了肿瘤抑制因子let-7 的功能[32];(3) LncRNA 可以表达生成miRNAs,从而对 mRNA 进行负调控[33]。有研究表明,LncRNA 肌肉特异性(muscle-specific, MD1)分别从一个内含子和一个外显子生成 miR-206 和miR-133b,参与了肌肉的分化过程[34]。也有文献报道,LncRNA H19 外显子中包含miR-675,可以通过调控miR-675 抑制出生前胎盘的生长[35]。

2.2.2 LncRNA 调控细胞自噬的其他途径

除了通过LncRNA-miRNA 轴调控外,也有研究发现LncRNA 可以直接影响自噬相关基因的表达,发挥调控细胞自噬的作用。Gao 等[36]报道,LncRNA 母源表达基因3(maternally expressed gene 3, MEG3)通过提高c-fos 表达和激活细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)通路来增加LC3-II/LC3-I 和Beclin 1 的表达,从而参与了吗啡引起的 HT22 细胞自噬。同样,Tong等[37]在心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤模型中发现,过表达LncRNA FOXD3 反义RNA 1(FOXD3 antisense RNA 1, FOXD3-AS1)可上调 LC3 II、Beclin1 和 ATG5 的表达,同时下调 p62 的表达,激活自噬的表达。

3 LncRNAs 在自噬诱导的神经系统疾病中的作用

3.1 LncRNAs 在自噬诱导的脑卒中的作用

有关LncRNA 在脑卒中疾病中的作用研究越来越多,已有研究发现在脑卒中的病理过程中,LncRNA 可通过LncRNA-miRNA 轴调控细胞自噬而发挥作用。LncRNA 转移相关的肺腺癌转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1) 可直接与miR-200c-3p 结合而下调miR-200c-3p 的表达,并减少与 SIRT1 的 3′UTR 结合从而促进脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs) 的 自 噬[38]。同 时,LncMALAT1 可作为miR-26b 的竞争性内源性RNA,激活 LncMALAT1 可下调 miR-26b 的表达并促进miR-26b 靶标ULK2 的表达,从而促进OGD/R 下的BMEC 自噬及增加细胞存活[39]。此外,也有研究发现LncMALAT1 还可以作为miR-30a 的分子海绵负调控miR-30a 的表达,靶向升高Beclin1 的水平参与脑卒中的发病[40]。

除LncMALAT1 外,其他 LncRNA 也与相应的miRNA 结合发挥调控细胞自噬作用。最近研究显示,敲除LncRNA 钾电压门控通道亚家族Q 成员1对侧链1(potassium voltage-gated channel subfamily Q member 1 opposite strand 1,KCNQ1OT1)可以显著促进miR-200a 的表达,从而抑制下游ATG7 的转录调节因子叉头盒O3(forkhead box O3, FOXO3)的表达,减轻脑卒中的损伤[41]。此外,Luo 等[42]证实了,在缺血性卒中神经元中,LncMEG3 与miR-378 特异性结合,上调Grb2 的表达,进而抑制Akt/mTOR 通路的激活,促进自噬的发生。

除LncRNA-miRNA 轴外,LncRNA 也可通过直接调控自噬来影响脑卒中。研究发现[43]OGD/R处理SH-SY5Y 细胞模型,LncRNA 小核仁RNA 宿主基因 12 ( small nucleolar RNA host gene 12,SNHG12)的上调可升高LC3-II/I 比值和Beclin-1 表达并降低p62 的表达,从而诱导自噬激活[43]。进一步研究发现,沉默LncRNASNHG12 还可通过激活PI3K/AKT/mTOR 信号通路,来减少I/R 处理的大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs) 的 凋 亡 和 自 噬 发 生[44]。表 明,LncRNASNHG12 可直接影响脑卒中的自噬信号通路的表达。

也有研究显示,LncRNAH19 在脑卒中疾病中发挥了重要的作用。曹雯等[45]发现在氧糖剥夺条件下的永生化人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3 中,敲低LncRNA H19 后抑制了 hCMEC/D3 细胞的增殖、迁移、成管能力,促进hCMEC/D3s 细胞凋亡并激活细胞自噬,从而抑制脑卒中后血管新生。同时,也有学者在I/R 处理的大鼠和 OGD/R 处理的SH-SY5Y 细胞体内外模型上,过表达LncRNAH19后可促进LC3-II 的表达,而给予H19 siRNA 处理可抑制OGD/R 诱导的自噬激活[46]。这些研究均揭示了,LncRNA 可靶向调控miRNA 或者直接干扰自噬相关蛋白影响自噬的发生发展过程。

3.2 LncRNAs 在自噬诱导的帕金森病中的作用

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是由黑质致密部位区域中多巴胺能神经元的进行性退化引起的,与年龄相关的神经退行性疾病。研究发现,HOXD 反义生长相关长非编码 RNA (HOXD antisense growth-associated long non-coding RNA,HAGLROS)的表达在 1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridine, MPP)诱导的 SH-SY5Y 细胞损伤模型和小鼠 PD 模型中均上调,同时,HAGLROS 可负向调控 miR-100 的表达并升高ATG10 的表达,促进自噬的发生,参与PD 发生的病理过程[47]。也有研究发现在体内外的PD 模型中,LncRNA 脑源性神经营养因子反义(brain-derived neurotrophic factor anti-sense, BDNF-AS)的表达上调和miR-125b-5p 的表达下调。双荧光素酶报告基因验证了BDNF-AS 与miR-125b-5p 之间具有负相关性。敲除BDNF-AS 通过上调 miR-125b-5p 的水平,从而抑制PD 模型的自噬和凋亡[48]。另有研究发现, LncSNHG1 可与miR-221/222 簇竞争性结合,从而间接上调了p27/mTOR 的表达[49]。以上研究提示,在帕金森的病理发病机制过程中,多种LncRNA 可通过LncRNA-miRNA 轴调控自噬。

此外,LncRNA 还可以直接作用于自噬,影响PD 疾病的发生发展过程。Yan 等[50]通过向小鼠腹腔注射 MPTP 建立 PD 模型,证实在 PD 小鼠中LncRNANEAT1 通过抑制同源性磷酸酶-张力蛋白诱导的假定激酶1 (phosphatase and tensin homolog induced putative kinase 1, PINK1)蛋白降解来促进PINK1 的表达、促进LC3-II/ I 蛋白的表达水平,加重PD 的发病过程。以上研究均表明, LncRNA 可通过作用于miRNA 或者直接调控自噬的过程,是PD 的潜在生物标志物以及可能的干预靶点。

3.3 LncRNAs 在自噬诱导的其他神经系统疾病中的作用

一些 LncRNA 也可通过 LncRNA-miRNA 轴调节自噬参与除脑卒中和PD 外的其他神经系统性疾病的病理发生发展过程。Wu 等[51]报道,LncRNAMALAT1 的下调使得miR-101 表达增多,激活PI3K/Akt 信号通路,从而保护癫痫大鼠海马神经元免受自噬和凋亡的影响。此外,脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是一种严重的神经系统性疾病,可引起一些破坏性症状,包括运动功能异常和自主神经功能紊乱。研究发现,在H2O2引起PC-12 细胞损伤处理复制的SCI 的细胞模型中,INK4 基因座中的反义非编码RNA(the antisense non-coding RNA in the INK4 locus, ANRIL)的表达水平增加,ANRIL 抑制了miR-499a 的表达从而靶向促进细胞程序性细胞死亡因子(programmed cell death protein 4,PDCD4) 的 表 达, 进 而 抑 制 PI3K/Akt/mTOR/p70S6K 通路并促进自噬,加重 SCI 的程度[52]。同样,在脊髓损伤模型大鼠脊髓组织和缺氧缺糖诱导的SY-SH-5Y 细胞模型中,出现LncRNA 结构家族成员2 (tectonic family member 2, TCTN2)的表达下调和microRNA-216B (miR-216B)的表达上调。过表达TCTN2 可通过靶向miR-216B-Beclin-1 通路增强自噬,从而善神经元凋亡,减轻脊髓损伤[53]。

多种LncRNA 可通过直接调控自噬的过程影响神经系统的其他疾病。Wang 等[54]证实过表达的LncRNA17 A 可促进LC3-II 的表达进而促进自噬,诱导神经退变,并使GABAB 信号失活。在AD 动物模型中,LncRNANEAT1 可以与神经前体细胞表达发育性下调4 样 (Neural precursor cell expressed developmentally downregulated 4-like, NEDD4L) 相互作用,促进PINK1 的泛素化和降解,进而抑制依赖于PINK1 的自噬并促进 AD 的发生[55]。此外研究者用相关动物模型研究并发现了多种直接调控自噬参与神经系统疾病相关的LncRNA。如Mai 等证实了LncRNA Lethe 通过增加LC3-II 并降低自噬蛋白SQSTM1 表达促进皮层神经元自噬,并对脓毒症脑损伤(sepsis-induced brain injury, SIBI)小鼠发挥保护作用[56]。另有研究表明LncRNA 浆细胞瘤变异易位1(plasmacytoma variant translocation 1,PVT1)激活细胞自噬,对糖尿病认知障碍患者海马神经元具有保护作用[57]。

4 总结与展望

越来越多的研究证明,LncRNA 能够在表观遗传水平、转录及转录后水平以及翻译水平影响基因的表达,广泛参与神经系统疾病的生理病理过程。最近的研究显示,LncRNA 可通过LncRNA-miRNA轴和直接作用于自噬过程两种途径在神经系统疾病发生发展中发挥着重要的作用,部分LncRNA 可作为神经系统疾病的潜在生物标志物和干预靶点,为我们后续的研究提供了重要的方向。然而现阶段大部分新发现的LncRNA 在神经系统疾病中的作用仍处于基础研究阶段,仍需要进一步的进行临床实验的验证。对LncRNA 的深入研究可为探讨神经系统相关疾病的发病机制和发现潜在的治疗新靶点提供理论依据。