基于TCGA和GEO数据挖掘分析PRC1在肺腺癌中的表达及预后意义

刘细帮 胡旭钢 唐夏莉 陈清勇

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）是肺癌最常见的病理亚型，患者5年平均生存率仅为15%[1-2]。尽管近年来诊断和治疗方法不断改进，但LUAD患者的总体生存率并未提高。因此，有必要寻找新的预后生物标志物，这不仅有助于改善个体化治疗，还能为开发新的治疗靶点提供参考。胞质分裂蛋白调节因子1（protein regulator of cytokinesis 1，PRC1）基因位于人体15号染色体上（15q26.1），编码含有620个氨基酸的蛋白；属于微管相关蛋白家族，参与细胞有丝分裂和细胞周期调控[3]。研究发现，PRC1 是乳腺癌[4]、膀胱癌[5]、肝细胞癌[6]和胃癌[7]等肿瘤的致癌因子，并且PRC1的表达与LUAD细胞的增殖、侵袭和凋亡相关，可能是LUAD潜在的治疗靶点[8-9]。但目前PRC1对LUAD患者总体预后影响的相关研究较少。本研究旨在通过对公共数据库的挖掘，分析PRC1 mRNA表达水平与LUAD患者总体预后的相关性，探讨其作为LUAD预后标志物的可行性，为今后有关PRC1的机制研究提供一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 PRC1数据的获取 33种肿瘤数据来自肿瘤免疫评估资源（tumor immune estimation resource,TIMER）数据库（https://cistrome.shinyapps.io/timer/），通过 Diff Exp模块检索PRC1在肿瘤组织与正常对照组织中的表达情况。通过肿瘤基因图谱（the cancer genome atlas,TCGA）数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）获取 PRC1表达的RNASeq数据，获得的数据中包含517例原发性LUAD患者和59例正常肺组织，其中504例LUAD患者记录了生存数据，并以PRC1 mRNA表达的中位数分为高表达组和低表达组。利用基因表达综合（gene expression omnibus,GEO）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）分别下载包含LUAD组织及正常对照组织或癌旁正常组织的基因表达谱芯片数据集GSE31210、GSE75037和 GSE68465，其中 GSE31210、GSE68465 数据集各包含226、362例LUAD患者完整的临床资料以及生存信息，并以PRC1 mRNA表达的中位数分为高表达组和低表达组。同时，从人类蛋白质图谱（human protein atlas,HPA）数据库（https://www.proteinatlas.org/）获取肿瘤以及正常对照组织中PRC1蛋白免疫组化染色数据。

1.2 基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）采用GSEA 4.0进行分析。根据TCGA数据库中PRC1 mRNA表达的中位数分为高表达组和低表达组，以Hallmark基因集作为参考基因集，通过GSEA分析PRC1参与LUAD发展的可能机制，设置置换次数为1 000次，以P＜0.05、错误发现率（false discovery rate,FDR）＜0.25为显著富集基因集。

1.3 统计学处理 采用R 3.6和GraphPad 8.0统计软件。计量资料以表示，两组比较采用两独立样本t检验或配对t检验；多组比较采用单因素方差分析。生存曲线分析采用Kaplan-Meier法，组间比较采用log-rank检验。采用R软件ROC的时间序列分析（timeROC）包绘制ROC曲线并计算AUC值。Cox回归模型分析PRC1与LUAD患者总生存期（overall survival,OS）、无进展生存期（progression-free survival,PFS）的关系，并计算HR值及其95% CI。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤组织中PRC1 mRNA表达 在TIMER数据库提供的33种肿瘤数据中，膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma,BLCA）、乳腺浸润癌（breast invasive carcinoma,BRCA）、胆管癌（cholangiocarcinoma,CHOL）、结肠癌（colon adenocarcinoma,COAD）、食管癌（esophageal carcinoma,ESCA）、头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma,HNSC）、肾嫌色细胞癌（kidney chromophobe,KICH）、肾透明细胞癌（kidney renal clear cell carcinoma,KIRC）、乳头状肾细胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma,KIRP）、肝细胞肝癌（liver hepatocellular carcinoma,LIHC）、LUAD、肺鳞癌（lung squamous carcinoma,LUSC）、胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma,PRAD）、直肠腺癌（rectum adenocarcinoma,READ）、胃癌（stomach adenocarcinoma,STAD）、甲状腺癌（thyroid car－cinoma,THCA）、子宫内膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC）17种肿瘤组织中PRC1 mRNA表达水平均高于正常对照组织，见图1。

图1 肿瘤组织中胞质分裂蛋白调节因子1（PRC1）表达

2.2 LUAD组织和正常对照组织中PRC1的表达 在TCGA数据库和GSE31210数据集中，LUAD组织中PRC1 mRNA表达水平均明显高于正常对照组织，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图2a-b。在GSE75037数据集中，LUAD组织中PRC1 mRNA表达水平明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2c。在HPA数据库中，PRC1免疫组化染色结果显示，PRC1蛋白在正常对照组织中弱表达，而在LUAD组织中强表达，见图2d-e。

图2 肺腺癌（LUAD）组织和正常对照组织中胞质分裂蛋白调节因子1（PRC1）的表达[a-b：肿瘤基因图谱（TCGA）数据库、GSE31210数据集中LUAD组织和正常对照组织中PRC1 mRNA表达水平比较，与正常对照组织比较，**P＜0.01；c：GSE75037数据集中LUAD组织和癌旁正常组织中PRC1 mRNA表达水平比较，与癌旁正常组织比较，**P＜0.01；d-e：正常对照组织和LUAD组织中PRC1蛋白表达的比较，免疫组化染色，×40]

2.3 PRC1 mRNA表达水平与LUAD患者临床特征的关系 通过TCGA数据库分析发现PRC1 mRNA表达水平与LUAD患者的年龄、M分期均无关（均P＞0.05），但与LUAD患者的性别、吸烟、T分期、N分期和TNM分期均有关（均P＜0.01），见表1。

表1 TCGA数据库中不同临床特征LUAD患者PRC1表达水平比较

2.4 PRC1 mRNA表达与LUAD预后的关系

2.4.1 PRC1 mRNA表达与OS和PFS的关系 在TCGA数据库、GSE31210和GSE68465数据集中，通过Kaplan-Meier生存曲线分析发现，除GSE68465数据集中的PFS外，其余PRC1高表达组患者PFS和OS均差于低表达组（均 P＜0.05），见图 3（插页）。

图3 胞质分裂蛋白调节因子1（PRC1）表达与总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）的关系[a-b：肿瘤基因图谱（TCGA）中PRC1高表达组与低表达组OS和PFS生存曲线比较；c-d:GSE31210数据集中PRC1高表达组与低表达组OS和PFS生存曲线比较；e-f:GSE68465数据集中PRC1高表达组与低表达组OS和PFS生存曲线比较]

2.4.2 影响LUAD患者预后的临床特征分析 在TCGA数据库中，ROC曲线模型的OS显示，1、3、5年生存率AUC值分别为0.674、0.632、0.590；ROC曲线模型的PFS显示，1、3、5年生存率 AUC 值分别为 0.611、0.583、0.506，见图4a-b。单因素Cox回归分析结果显示LUAD患者的性别、年龄和吸烟与OS均无关（均P＞0.05），但T分期、N分期、TNM分期和PRC1 mRNA表达水平与OS均有关（均P＜0.05）；单因素Cox回归分析结果显示LUAD患者的性别、年龄、TNM分期和吸烟与PFS均无关（均P＞0.05），但T分期、N分期和PRC1 mRNA表达水平均与PFS均有关（均P＜0.05）。将以上所有单因素纳入多因素Cox回归分析显示，T分期、N分期和PRC1 mRNA表达水平均是影响LUAD患者OS和PFS的独立危险因素（均P≤0.05），见图4c-f。

图4 影响肺腺癌（LUAD）患者预后的临床特征分析[a-b：肿瘤基因图谱（TCGA）数据库中总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）的ROC曲线；c-d：TCGA数据库中OS单因素和多因素Cox分析；e-f：TCGA数据库中PFS单因素和多因素Cox分析]

2.5 GSEA识别与PRC1相关的信号通路 为了确定PRC1作用的潜在信号通路，在TCGA数据库中，GSEA分析结果显示，PRC1高表达样本富集在有丝分裂纺锤体、G2M检查点、E2F信号通路、DNA修复等基因集中，见图5。

图5 基因集富集分析（GSEA）识别与胞质分裂蛋白调节因子1（PRC1）相关的信号通路

3 讨论

细胞周期是哺乳动物细胞生长和发育所必需的进化保守过程，因为细胞周期畸变是癌症的标志[10]。PRC1被认为是细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）底物，在早期细胞分裂中，是维持纺锤体中段所需的微管相关蛋白[11-12]。细胞分裂是一个复杂的过程，涉及复杂的生化和细胞动力学因素[10]，而PRC1作为细胞分裂的关键蛋白，其表达异常可引起细胞分裂的紊乱。研究表明，PRC1的过表达通过调节Wnt信号通路促进肝癌细胞增殖和转移，并与早期复发和患者预后不良相关[6]。敲除PRC1可显著抑制胃癌细胞增殖，减少胃癌细胞克隆形成并抑制其侵袭和迁移[7]。但是，目前PRC1在肺癌的发生、发展机制方面的研究较少，尤其是与患者临床预后生存及标志物筛查的研究鲜有报道。

本研究中，笔者通过对多个大样本数据库进行分析发现，PRC1的表达水平在包括LUAD在内的多种肿瘤组织中上调，LUAD组织中PRC1表达也明显高于正常对照组织和癌旁正常组织；且免疫组化结果提示，LUAD组织中PRC1蛋白表达水平明显高于正常对照组织。在TCGA数据库和GSE68465数据集中，PRC1表达与肿瘤的T分期、N分期和TNM分期均有关，提示PRC1可能参与LUAD的进展。基于多个数据库的生存分析结果，表明PRC1 mRNA表达水平与LUAD患者的PFS、OS呈负相关，其表达水平越高，LUAD患者预后越差。并且该结果与Bu等[13]研究结果类似，该研究发现在卵巢癌组织PRC1呈高表达，并且PRC1的表达与生存时间呈负相关。

单因素及多因素Cox回归分析显示，T分期、N分期和PRC1 mRNA表达水平均是影响LUAD患者的独立危险因素。为了进一步探讨PRC1在LUAD中的潜在功能，GSEA分析结果表明，在有丝分裂纺锤体、G2M检查点、E2F信号通路、DNA修复等通路高度富集。G2M检查点能在DNA损伤的情况下阻止细胞周期，使细胞在进入下一个细胞周期阶段前修复DNA损伤，从而维持基因组完整性[14]。因此，PRC1过表达时可能通过影响细胞周期和DNA修复，从而促进LUAD细胞的增殖分化。CDK-RB-E2F轴是细胞周期进程的核心转录机制，该轴的一个或多个关键组成部分的变化几乎发生在所有肿瘤中，并导致致癌E2F活性增强，使肿瘤细胞增殖不受控制，进而导致肿瘤进展[15]。而PRC1作为CDK底物，过表达时可能促进该轴的转录，进一步增加E2F活性，导致肿瘤进展。由此可见，PRC1可能参与LUAD发生、发展过程，可能是LUAD治疗的潜在靶点。

综上所述，PRC1基因在LUAD中可能是一个潜在的致癌基因。PRC1在LUAD中的表达与肿瘤的发生、发展以及患者的预后有着非常密切的关系，可作为一个重要的候选生物标志物。因此，有必要对该基因在LUAD中的机制以及功能进一步研究，为全面掌握PRC1在肿瘤中的作用以及LUAD的预防诊治提供更多依据。