吉林省玉米种植区土壤真菌群落多样性特征研究

王媛媛，王继岩，焉 莉*，韦大明，高 强

（1.吉林省商品粮基地土壤资源可持续利用重点实验室，吉林农业大学资源与环境学院，吉林 长春 130118；2.总量控制与排放交易研究中心，国家生态环境部环境规划院，北京 100085）

吉林省位于我国东北地区中部，土地面积约18.74万km2，农业自然生态环境良好。吉林省是我国重要的黑土地保护区。玉米是吉林省第一大粮食作物，根据中华人民共和国国家统计局数据统计［1］，2017年吉林省玉米播种面积占全国玉米播种面积的8.72%，而产量占全国玉米产量的12.55%。除了现代的耕作技术外，肥沃的土壤是促其高产的主要原因，但近年来黑土区土壤退化严重。土壤微生物群落反映的土壤质量和生态系统变化是判定土壤的性质和生态功能的重要指标［2］。因此可以通过分析和解释土壤的异质性，从微生物的群落结构组成来探究土壤微生物的变化特征［3］。

土壤微生物对外界的感知能力极为敏感［4-5］，真菌是土壤微生物中数量最多的类群之一，是陆地生态系统的重要组成［6-7］，在提高土壤有机质、改良土壤［8］、增加植物多样性、提高生态系统生产力［9］等方面有显著作用，是评价生态系统健康的重要指标［10-11］。同时，土壤的理化性质和土壤酶

活性对微生物群落结构组成也有一定的影响［12］。相关研究发现，土壤有机质含量与土壤微生物多样性呈正相关［13］。史铭儡等［14］研究发现，pH与真菌数量呈正相关，有机质、有效磷、速效钾、碱解氮与真菌数量呈负相关，且土壤的pH是影响土壤真菌数量的主导因素。近年来，高通量测序技术因其准确率高，灵敏度好，单次分析样品量大等优势［15］，已成为研究土壤微生物的主要方法。

本研究以吉林省玉米种植区的72个样本土壤为研究对象，测定其土壤理化性质、酶活性及真菌微生物的群落结构，探索吉林省玉米主产区的土壤微生物构成特点及差异，以期阐明土壤群落与土壤养分之间的相互关系，为黑土区退化土壤恢复提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集

吉林省位于我国东北中部，东经121°38′～131°19′，北纬40°52′～46°18′。地势东南高、西北低，分为山地和平原两大地貌区。土壤样品采集于吉林省玉米主要种植区的9个市，分别位于延边、白山、吉林、通化、四平、辽源、长春、白城、松原，各个采样点的详细信息如表1所示，地理位置信息见图1。本研究于2017年6月上旬对吉林省各玉米主产区土壤样品进行采集，土壤类型包括黑土区的白浆土、黑土、暗棕壤、黑钙土和风沙土，采样深度0～20 cm，采用五点采样法，共采集了75份不同的土壤样品，每种土壤样品重复采集3次，试验结果取其3次重复的平均数，以确保试验的精确度。其中有3个土壤样品因基础信息丢失，故将这3个样品进行剔除，将剩余合格的72个样品进行多样性分析，以确保试验的准确性。所有样品采集后立即过2 mm筛，然后分成3份，1份保存于-80℃冰箱中用于高通量测序，1份存放在4℃冰箱用以测定土壤的酶活性，1份土壤风干保存用以测定土壤的理化性质。

表1 吉林省土壤样品采集地理位置详细信息

1.2 理化性质、酶活性的测定和高通量测序

1.2.1 理化性质及测试方法

风干的土壤样品用以进行理化性质的分析：pH值用电位法测定［16］，水土比为2.5∶1；土壤有机质含量用重铬酸钾容量法［16］（外加热法）测定；碱解氮含量用碱解扩散法［16］测定；有效磷用钼锑抗比色法（0.5 mol/L 碳酸氢钠浸提）［16］测定；速效钾用火焰光度法（醋酸铵浸提）［16］测定。

1.2.2 酶活性及测定方法

测定方法：保存于4℃冰箱中的土壤样品进行酶活性测试：脲酶活性采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定［17］，以24 h后1 g土壤中含NH3-N的毫克数表示。蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定［18］，以24 h后1 g干土生成葡萄糖毫克数表示。磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液，中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液，碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液）测定［18］，以24 h后1 g土壤中释放出酚的毫克数表示。每个样品均做无基质对照和无土对照，且所有样品均做3次重复，以尽可能消除误差，来保证试验数据的准确度。

1.2.3 Miseq高通量测序分析

保存于-80℃冰箱中的土壤样品采用Fast DNA SPIN提 取 试 剂 盒（MP Biomedicals，Santa Ana，CA，United States），每个样本称取0.5 g土壤以提取DNA，通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA质量，同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量。质量合格的样品送至上海派森诺生物公司采用ITS5F/ITS2R对土壤真菌进行Miseq测序，首先对ITS区进行扩增，扩增前引物序列为GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG，后引物序列GCTGCGTTCTTCATCGATGC。使用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 进行建库。对合格的文库，在 MiSeq 机器上利用 MiSeq Reagent Kit V3（600cycles）进行 2×250 bp 的双端测序。

1.3 数据分析

使用QIIME中的OTU表计算操作分类单元中Chao1指数、Shannon指数、ACE指数以及Simpson指数。使用R软件生成维恩图，分析样品中的共有和独有OTU数量关系。利用SPSS 18.0进行不同类型土壤真菌丰度数据的单因素分析（ANOVA），用Duncan分析不同土壤类型间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同土壤类型的理化性质

不同土壤类型的土壤化学性质表现出显著差异（表2），且pH值的差异性尤其显著。其中，黑钙土的pH偏高，呈碱性；风沙土和黑土的pH值在6～8之间，呈中性；暗棕壤和白浆土pH偏低，呈酸性。暗棕壤、黑土及白浆土的有机质含量较高，黑钙土次之，风沙土有机质最低。碱解氮、速效钾和有效磷含量也有相同趋势，通过表2分析可知，风沙土的土壤肥力显著低于其他4类土壤类型。

表2 不同土壤类型的理化性质

2.2 不同土壤类型的酶活性特征

土壤酶来源于土壤微生物，与土壤理化性质、土壤类型等密切相关，本文选用脲酶、蔗糖酶以及磷酸酶3种酶作为代表性酶。土壤脲酶是土壤中最活跃的水解酶之一，其活性和微生物量、有机质含量、有效磷含量呈正相关，可表征反映土壤中的氮素含量，其活性的提升有利于使土壤中稳定的有机氮向有效氮转化［19-20］；一般中性土壤脲酶活性大于碱性土壤［21］。通过表3分析可知，在本次调查的土壤样品中，5种不同土壤类型中脲酶活性的差异显著，黑钙土和风沙土的脲酶含量明显低于其他3种土壤类型，可能是黑钙土和风沙土的pH相对较高造成的。

蔗糖酶是重要的水解酶，可直接参与土壤有机质的代谢，反映土壤生物学活性强度［22］，参与碳水化合物的代谢和转化，将高分子糖分分解为葡萄糖和果糖，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越强，是表征土壤碳循环和生物化学活性的重要酶［18，23］。本研究发现，黑钙土和风沙土的蔗糖酶活性显著优于其他3种土壤。

土壤磷酸酶是催化有机磷化合物的酶，可保证土壤、植物和微生物无机磷的供应，其活性影响土壤有机磷的分解转化及其生物有效性［24］。根据分析发现，pH偏碱性的黑钙土和风沙土土壤的碱性磷酸酶活性较高，白浆土、黑土、暗棕壤等pH偏酸性土壤的酸性磷酸酶偏高。

表3 不同土壤类型酶活性 ［mg/（g·d）］

2.3 不同类型土壤真菌多样性指数

Alpha多样性指数是反映菌群丰富度和均匀度的综合指标，Chao1 和ACE数值越大表示该土壤类型中真菌微生物的丰富度越高；Shannon和Simpon为该土壤类型中真菌群落多样性指数，Shannon数值越大，说明其群落多样性越高，Simpon又称优势度指数，其值越高表明其群落多样性越低，相对来说，Simpon指数对物种均匀度更为敏感，而Shannon指数对物种丰富度更为敏感［25］。根据Alpha多样性指数（表4）可知，从Chao1指数和ACE指数可以看出，黑钙土和风沙土的平均值显著高于白浆土和暗棕壤，具有较高的真菌菌群丰度；变异系数和标准差都是反映数据离散程度的绝对值，从各土壤类型的变异系数可看出，黑土、黑钙土和风沙土3种类型土壤的Chao1指数变异系数分别为18.91%、17.84%和17.31%，显著低于白浆土和暗棕壤的变异系数，说明黑土、黑钙土和风沙土3种土壤类型的样本间差异相对较小，真菌微生物的均匀度较好。从Shannon和Simpon指数分析结果表明，5种不同土壤类型的真菌多样性差异不显著，Simpson指数的平均数在0.94～0.96之间，Shannon指数的平均数在5.97～6.26之间，其变异系数均较低，且相同土壤类型的不同样本间差异不显著。

表4 不同土壤类型Alpha多样性指数

2.4 不同类型土壤真菌群落结构组成

在本研究的所有土壤样品中，通过高通量测序及分析得到可分类OTU共4273个，不同类型土壤间OTU种类数目各不相同：白浆土2511个、黑土2393个、暗棕壤2166个、黑钙土2731个、风沙土2176个。其中5种类型土壤共包含OTU 775个，占各土壤类型的28%～36%。5种土壤类型特有的OTU数目及其所占比例分别为白浆土331个、13.18%，黑土109个、4.55%，暗棕壤156个、7.20%，黑钙 土401个、14.68%，风 沙 土90个、4.14%（图2）。这表明同样种植玉米的土壤中不同类型土壤间真菌群落组成相似，但仍存在部分差异。

土壤真菌在门、纲、属分类水平上的相对丰度如图3、图4、图5所示。吉林省玉米种植区5种土壤类型72个土壤样品中共鉴定出9个真菌门，其中，子囊菌门（Ascomycota）为相对丰度最高的优势菌门（65.21%～80.15%），其次是担子菌门（Basidiomycota，13.78%～28.06%）和接合菌门（Zygomycota，1.32%～5.13%），壶菌门（Chytridiomycota，0.28%～1.78%）和隐真菌门（Rozellomycota，0.01%～0.05%）占比最少，两者之和仅为0.99%～2.54%。风沙土、黑钙土和暗棕壤的子囊菌门相对丰度显著高于白浆土和黑土，与之相反，白浆土和黑土中担子菌门的相对丰度显著高于风沙土、黑钙土和暗棕壤。而暗棕壤的接合菌门丰度则显著高于其他4种土壤类型。

在纲水平上，吉林省玉米种植区主要以粪壳菌纲（Sordariomycetes，25.61%～38.20%）相对丰度最高，其次是银耳纲（Tremellomycetes，3.78% ～ 13.24%）、散囊菌纲（Eurotiomycetes，7.12% ～ 12.81%）、伞菌纲（Agaricomycetes，3.06% ～ 15.54%）、座囊菌纲（Dothideomycetes，4.43% ～ 12.75%）和锤舌菌纲（Leotiomycetes，1.83%～ 9.51%）。其中银耳纲分别在黑土、黑钙土和风沙土中占据优势；伞菌纲在白浆土、黑钙土和暗棕壤中优势较大；而座囊菌纲在黑钙土和风沙土中优势较大。

属水平上，吉林省玉米种植区不同土壤类型中土壤相对丰度大于1%的菌属分别是酵母菌属（Guehomyces，0.26%～2.54%）、青霉菌属（Penicillium，0.16%～1.30%）和腐殖霉属（Humicola，0.21%～1.10%）。其中黑土、黑钙土以及风沙土的酵母菌属（Guehomyces，0.26%～2.54%）和青霉菌属（Penicillium，0.16%～1.30%）的相对丰度明显高于白浆土和暗棕壤；而腐殖霉属在黑土和风沙土中占据明显优势。

2.5 土壤真菌群落与环境因子的冗余分析

为了反映土壤环境对真菌微生物群落组成的影响，将不同土壤类型的土壤理化性质（pH值、有机质、碱解氮、有效磷、速效钾）及土壤酶（脲酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶、中性磷酸酶和酸性磷酸酶）活性与属分类水平下真菌群落组成，采用冗余分析（RDA）的方法，从而更加直观、清晰地体现出土壤理化特性对土壤真菌群落遗传多样性及优势类群的影响。图6中的射线越长，说明该因子影响程度越高，两条射线夹角为锐角，说明两因子之间呈正相关；若夹角为钝角，则说明两者呈负相关。从不同土壤类型的真菌群落和土壤理化性质及酶活性的RDA分析结果（图6）可知，土壤环境因子中pH射线最长，有机质次之，因此pH和有机质对真菌微生物群落结构影响程度最高；同时可以看出pH值和蔗糖酶活性、碱性磷酸酶活性呈正相关，且相关性较好；而有机质与中性磷酸酶的相关性较好。从5种土壤类型的分布看，黑钙土和风沙土分布在PDA1坐标轴的正方向，而白浆土和暗棕壤则分布在PDA1坐标轴的负方向，黑土分布在坐标轴附近；而在PDA2坐标轴上，黑土和暗棕壤则主要分布在正方向，而大部分白浆土分布在负方向，黑钙土和风沙土则在坐标轴附近。白浆土和暗棕壤样本分布距离较远，说明该两种土壤的微生物群落结构有各自独特的特点，而黑钙土和风沙土分布较近，说明这两种土壤类型的微生物群落结构相似。pH值对黑钙土和风沙土影响较大，而有机质对黑土及暗棕壤影响较大。综上所述，土壤pH值和有机质对土壤真菌微生物群落多样性的影响显著，是5种土壤类型真菌微生物群落的主要影响因子。

采用R软件，通过物种丰度矩阵和样本分组数据构建PLS-DA判别模型，对群落结构数据进行判别。图7可知，吉林省玉米种植区5种土壤的微生物特征存在一部分共性，也存在显著差异。暗棕壤和白浆土之间存在明显的分离，表明了这两种土壤微生物群落结构存在显著差异。

3 讨论

本次研究发现，吉林省玉米种植区不同土壤类型的理化性质、生物酶活性及真菌群落结构组成存在一定的相似性，但也存在差异。

吉林省是我国玉米的主要产区之一，玉米产量相对较高的是中部平原区［26］，平均产量为9.45 t/hm2，其土壤类型主要是黑土、黑钙土和白浆土，其有机质相对较高；其次是东部山地丘陵区，平均产量为8.44 t/hm2，主要土壤类型是暗棕壤和白浆土，土壤偏酸；西部风沙草原区的玉米产量相对最低，平均值为8.11 t/hm2，其主要土壤类型是风沙土和黑钙土，风沙土的有机质相对较低，导致其土壤肥力较差，玉米产量较低。本研究的土壤理化性质分析结果表明，吉林省玉米种植区黑钙土的pH呈明显碱性，白浆土、暗棕壤的pH呈酸性，黑土和风沙土呈中性，此结果与王寅等［27］研究结果一致。土壤养分是衡量土壤综合生产力的重要指标，而土壤有效养分与土壤碱解氮、有效磷和速效钾之间存在一定的关系［28-30］，本文研究结果显示，有机质和碱解氮含量最高的土壤类型是暗棕壤，最低的是风沙土，有效磷和速效钾含量最低的是黑钙土，这一结果与吕岩等［31］、焉莉等［32］、李春林等［33］、陈敏旺等［34］研究结果相一致。而随之土壤碱性越强，土壤有效磷含量明显降低，主要原因是土壤pH对土壤磷的利用及其有效性有一定影响［35］，随着pH的提高，土壤对磷的吸附降低［36］。

土壤酶是催化土壤有机质分解的活性蛋白质，对植被、水分、营养元素含量等因素十分敏感［37］，脲酶可以将尿素分解成氨、二氧化碳和水，对氮素转化起重要作用［38-39］；蔗糖酶也叫转化酶，与土壤有机质含量呈正相关，与土壤pH呈一定的负相关［40］；土壤磷酸酶活性可作为指示土壤肥力的指标，无论是酸性磷酸酶还是碱性磷酸酶都与有机磷和有效磷含量显著正相关［41-42］。本次酶活性分析结果与李林海等［43］的研究结果相一致，脲酶、蔗糖酶和碱性磷酸酶活性之间呈显著正相关，且均与pH呈正相关关系。

土壤微生物是土壤地力关键驱动因子之一，参与90%左右的土壤反应过程［44］。各地区不同类型土壤中，分布着不同种类结构的微生物，气候条件不同、成土母质不同的土壤中，真菌多样性及结构也存在明显差异。尤其是土壤呈碱性的黑钙土和弱碱性的风沙土与土壤呈酸性的暗棕壤及白浆土的微生物丰度差异显著，冗余分析表明pH对其影响显著，可能原因是pH会影响微生物群落的生长、代谢、底物转化及菌群构成［45］。前人的很多研究均表明土壤细菌、放线菌、微生物总数与pH值呈显著负相关，说明高碱性土壤不适合土壤微生物的生长［46-48］。而本研究发现5种不同土壤类型的真菌微生物多样性差异不显著，可能由于在局部生态条件相似的不同地区，土壤中的真菌群落极有可能相似［49］。土壤的健康情况可以通过土壤微生物群落状态和功能变化来表明［50］。本次研究结果表明，吉林省玉米种植区5种类型土壤的子囊菌门和担子菌门相对丰度较高，是该地区土壤真菌群落中有机质的主要分解者，并参与土壤的氮循环，对植物生长具有重要作用［51］。与此同时，通过Chao1指数和ACE指数可看出，黑钙土和风沙土的真菌丰度显著高于白浆土和暗棕壤，且黑土、黑钙土和风沙土3种土壤类型的变异系数相对较低，说明样本间差异相对较小，真菌微生物的均匀度较好。黑土区主要土类包括黑土、黑钙土、白浆土和暗棕壤［52］。黑土和黑钙土是吉林省主要的土壤类型，是东北温带湿润、半湿润气候区草原化草甸植被下形成的具有深厚腐殖质层的一类土壤［53］。因透气性强、保水性好，自然肥力较高而成为世界最适应农耕的土地。近年研究发现，持续的无机肥大量施用导致微生物群落结构变化，从而引起黑土区退化及生态环境恶化［54］。周晶［55］的研究表明，长期施肥导致黑土区中真菌群落变化显著，影响了具有某些碳循环和氮循环功能的真菌，刺激有潜在致病力类群真菌的生长繁殖，导致土壤退化。

4 结论

吉林省玉米种植区不同类型土壤的微生物群落结构既有一定的相似性，同时也存在一定的差异性。黑钙土和风沙土的真菌丰度要显著高于白浆土和暗棕壤，5种土壤类型的真菌多样性差异不显著。土壤pH值和有机质是影响土壤真菌微生物群落多样性的主要驱动因子。