褪黑素在骨肉瘤治疗中的应用机制

谭芷芬,张宏方∗,郝晓霞,蔡 婧

(1.陕西中医药大学医学技术学院,西安 710000;2.西北大学生命科学院,西安 710000;3.陕西中医药大学基础医学院,西安 710000)

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)大多起源于间充质干细胞(MSC)或更定向的骨祖细胞,占原发性恶性骨肿瘤发生率的25%~30%,是儿童与青少年最常见的骨肿瘤。 骨肉瘤病发原因和具体机制目前尚未明确,治疗手段十分有限,而手术治疗是骨肉瘤治疗的主要手段。 对于某些晚期骨肉瘤患者,术后复发患者或处于转移期的患者来说,只能通过药物与大剂量的化疗姑息性治疗。 伴随新辅助化疗方案的实施,骨肉瘤患者的5 年生存率已有较大提高[1]。 因此,寻找并开发新的有效药物,从而提高骨肉瘤患者的生存率和生存质量是当前临床上亟待解决的重要问题。

褪黑素(melatonin,MT),又称N-乙酰基-5-甲氧基色胺,是一种由松果体产生的吲哚类激素。 昼夜的节律变化、四季的更改替换和环境光信号的强弱变化均能影响机体褪黑素的含量。 褪黑素在不同生理状态中均发挥着不同的作用,如调节睡眠-觉醒周期、抗氧化和改善机体免疫功能等[2]。 体内外实验表明,褪黑素可减缓诸如肝癌、乳腺癌、卵巢癌等疾病的发生发展[3]。 此外,褪黑素在骨骼的形成中也发挥着至关重要的作用,其激素水平与骨代谢密切相关,而褪黑素的缺乏可能与骨肉瘤的形成和发展相关[4]。 因而,褪黑素能够作为一种潜在的治疗候选或作为佐剂与其它抗肿瘤剂共同作用于骨肉瘤治疗。

1 骨肉瘤发病机制

骨肉瘤的发病原因复杂,目前认为化学物质、电离辐照、基因突变、相关病原病毒感染等可能与其发病相关[5],主要发病人群为儿童和青少年,发生部位通常位于长骨干骺端,具有发现晚、进展快、浸润与转移早、死亡率高等特点,且多数骨肉瘤患者的病因学仍不明确。 骨肉瘤患者最初的临床症状表现为关节周围轻度疼痛伴酸胀感,伴有组织肿胀,后可触及疼痛部位的肿块,伴有局部红肿和关节活动受限,多表现为持续性疼痛,夜间加重,通过休息与药物治疗,疼痛未见明显缓解。 临床上尚无统一标准对骨肉瘤分型,可根据骨肉瘤的具体位置,肿瘤分化程度,肿瘤组织特征等进行分类。

1.1 骨肉瘤的发生与基因遗传学相关

基因突变是骨肉瘤发生的重要原因之一。 通过基因组范围的预测、基因表达的评估和表观遗传修饰的分析,研究者们指出骨肉瘤与复杂的克隆性染色体数目和染色体结构异常、乳酸脱氢酶增高、分子遗传学改变和基因产物过度表达相关[6-7]。 最常涉染色体数量与结构异常及基因的过度表达,涉及的染色体有12q13-15、3q26、1p21-23、8121-23、17p11-12 等;涉及的基因有细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、MET 原癌基因(MET)、FOS 基因家族(FOS、FOSB、FOSL1 和FOSL2)、MDM2 癌基因、MYC 癌基因(C-myc, N-myc, L-myc)等[8-9]。 骨肉瘤中MYC、CDK4 和MDM2 基因的过度表达则多表明骨肉瘤预后差[7]。 例如,许多肿瘤的发生与WWOX 基因的表达相关,WWOX 作为一种肿瘤抑制因子,与肿瘤的侵袭性和预后有关。 如骨肉瘤患者的病例中,约有30%的病人可观察到WWOX 基因的减少,直观的表达了基因的突变与缺失与骨肉瘤密切相关[10]。 此外,在散发性骨肉瘤中存在P53基因和视网膜母细胞瘤基因1 (Rb1)突变的情况[9]。 Rb1 基因突变导致转录因子E2F 功能增强。在原发性骨肉瘤中,高水平的E2F1 具有生长抑制作用,如P73 诱导[11]。

1.2 骨肉瘤的发生与细胞的异常增殖和凋亡相关

骨肉瘤的发展与调控细胞生长的癌基因的过度表达有关。 例如:参与骨肉瘤的信号通路网络之一细胞外调节蛋白激酶ERK 是丝裂原活化蛋白激酶MAPK 家族中重要的成员,调节细胞的增殖和凋亡。 高天等人证实,柴胡皂苷D 可以使ERK1/2 的表达下降,肿瘤细胞的增殖作用减弱,而肿瘤细胞凋亡作用加强[12]。 同时,骨肉瘤的发生与抑癌基因的变异、丢失和失活有关,例如野生型P53 基因是肿瘤相关的抑癌基因,调控相关转录因子,参与转录的下游靶基因失活,并通过细胞凋亡和细胞周期阻滞等途径抑制肿瘤增殖与转移。 P53 基因失活(即突变型P53)能够抑制肿瘤细胞凋亡,在肿瘤组织与细胞中高表达,进而发挥血管生成、侵袭和转移的作用。 张跃[13]发现细菌氧化还原蛋白Azurin可以结合P53 基因而稳定P53 蛋白结构,其抑制了骨肉瘤的生长。 PTEN 基因为双专一性磷酸酶活性抑癌基因,PTEN 蛋白低表达时,提示恶性肿瘤发生或进行性生长。 据报道PTEN 蛋白在骨肉瘤中低表达,为miR-208a-3p 的直接靶点,PTEN 蛋白失活使细胞周期负调控能力异常,其与miR-208a-3p 的表达呈负相关,促进骨肉瘤发生[14]。

此外,骨肉瘤的发生与抑制细胞凋亡的癌基因表达高度相关。 Bcl-2 家族蛋白受线粒体调节进而发挥促细胞凋亡作用,Bcl-2 与骨肉瘤的预测、预防、发生、发展过程高度相关。 高宇等发现,在骨肉瘤中下调Bcl-2 的水平可抑制骨肉瘤细胞的增殖。 此外,正常骨组织Bcl-2 的阳性表达率低,但在骨肉瘤中高度表达[14]。 Bag-1 是Bcl-2 结合抗凋亡基因,Bag-1 编码的蛋白可以通过与多种分子靶点相互作用进而调节细胞的生长调控途径(包括凋亡、信号转导、增生、转录和细胞能动性等[15]),在肿瘤中表现尤甚。 多种恶性肿瘤中Bag-1 阳性表达,同时Bag-1 可以与Bcl-2 结合,增强Bcl-2 的抗凋亡作用,而后者也可单独抑制细胞的凋亡[13]。 Mcl-1 是Bcl-2 家族蛋白抗凋亡亚家族中的另一种抗凋亡蛋白,并在各种恶性肿瘤中高表达,下调Mcl-1 可以促进细胞凋亡[16]。 在阿霉素作用下,骨肉瘤中Mcl-1 蛋白呈高表达,同时经Mcl-1 转染后,过表达Mcl-1 可以抑制Caspase3/7 的活化[16]。 Bcl-xl 表达下调与caspase-3 的表达上调相关,显著增强了肿瘤的放射敏感性和化学敏感性[17]。 此外,TGF-β 蛋白是五种异构体(转化生长因子-β1-5)超家族的成员之一,对骨肉瘤细胞系具有促有丝分裂作用。 TGF-β1 生长因子在肿瘤中起着促进与抑制的“双刃剑”作用,即早期抑制肿瘤生长,晚期则促进肿瘤的侵袭、迁移[18]。 同时,青少年在青春期飞速成长,骨生长率与骨肉瘤的发生率可能存在相关性,性激素的紊乱也是骨肉瘤的发生原因之一,大量的性激素与对应的受体可直接影响骨肉瘤的生长[19]。

2 褪黑素作用于恶性肿瘤的机制研究

褪黑素是哺乳动物的松果体、胃肠道、视网膜和骨髓等器官分泌的一种吲哚类激素。 褪黑素在多项实验中均表现出显著的抗肿瘤作用,被认为是治疗肿瘤的潜在药物,具有强大的抗氧化与抗炎作用。 在正常细胞中,褪黑素发挥抗凋亡作用,而肿瘤细胞中则发挥促凋亡作用[20]。

2.1 褪黑素通过促凋亡抑制肿瘤生长的研究

褪黑素诱导肿瘤细胞发生凋亡,可通过坏死、核破碎、核溶解等途径影响细胞,而这正是褪黑素能够发挥肿瘤治疗作用的重要原因。 褪黑素能够增强肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的宫颈癌Hela细胞凋亡,并与TNF-α 共同作用引起线粒体能量代谢紊乱,使线粒体凋亡介导的宫颈癌Hela 细胞凋亡[21]。 细胞朊蛋白(Cellular prion protein,PrPC)在神经、肌肉和心脏等多种组织的细胞中高度表达,而褪黑素能够诱导PrPC 低表达,从而活化LKB1/AMPK/mTOR 信号通路,并最终降低膀胱癌的发生[22]。 在MDAMB-361 乳腺癌细胞中,褪黑素具有促凋亡作用,通过抑制p300/NF-κB、COX-2/PGE2和PI3K/AKT 信号通路来增加凋亡酶激活因子Apaf-1 的表达[23]。 此外,褪黑素能够增加Bax 的表达,并诱导细胞色素C(cytochrome C)、Bax 和p53 的释放并抑制Bcl-2 释放,刺激caspase3、6、7、9 活性裂解,进而诱导卵巢癌凋亡[24]。

2.2 褪黑素通过抗增殖抑制肿瘤生长的研究

延缓肿瘤细胞的增殖能力、抑制肿瘤的发生发展,是褪黑素抗击肿瘤的另一优势。 褪黑素能够激活正常细胞中的ERK1/2 而抑制肿瘤细胞中的ERK1/2,从而发挥抗肿瘤细胞增殖的作用,并降低肿瘤对化疗的耐药性。 研究表明,ERK1/2 可调节细胞分裂,而褪黑素可阻止细胞内ERK1/2 的表达。在胃癌细胞系MFC 细胞中,褪黑素干预能够下调ERK1/2 与Akt 的磷酸化水平,并发挥胃癌细胞的抗增殖作用。 在肿瘤演变过程中,TGF-β1 信号通路可发生异常,某些肿瘤细胞(如胃癌细胞)可以合成分泌TGF-β1。 宋军[25]研究发现,大剂量的褪黑素能够抑制胃癌患者血清中TGF-1β 的分泌,下调胸腺中CD4+CD25+Treg 的表达。 凋亡抑制因子Survivin 的低表达可增加肿瘤的细胞凋亡和化疗敏感性,并发挥抗肿瘤作用。 褪黑素可以延长细胞在G0/G1 期积聚或延迟进入S 期发挥抗增殖作用。如HepG2 肝癌细胞中,给予褪黑素干预后,HepG2细胞中可见周期滞留和凋亡[26]。 鲁倩倩[26]的研究证明了褪黑素可以使肿瘤细胞滞留于G1 期,进而减少S 期细胞。

2.3 褪黑素在肿瘤预防转移中的作用

肿瘤转移一直是临床中迫切解决的问题,褪黑素已被证明有预防各种肿瘤转移的作用。 例如在肺癌与前列腺癌的骨转移中,褪黑素可直接减少骨细胞分化,骨吸收活性,促进成熟骨细胞的凋亡,下调p38/MAPK 通路表达,抑制RANKL 产生[27]。 基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、人表皮生长因子受体-2(HER2) 和MAPK/ERK 信号通路的激活可增加肿瘤细胞的侵袭力,肿瘤血管新生和淋巴管新生促进肿瘤细胞的浸润和转移[28]。 研究表明,褪黑素的使用可显著降低MAPK/ERK 的表达,抑制肿瘤细胞的生长,并减少肿瘤治疗中化疗和放疗引起的氧化应激和毒性[29]。 在对卵巢癌细胞SKOV3 的研究中发现,褪黑素能通过阻止上皮间质转化相关的能力,对卵巢癌细胞SKOV3 产生一定的毒性,并抑制卵巢癌细胞SKOV3 的浸润与转移[24]。 而在联合用药中,褪黑素通过PI3K/AKT 和Jak/Stat3 信号通路与脂多糖(LPS)联用解除由M1 型巨噬细胞发生的LPS 耐受,使巨噬细胞维持M1 型以实现抗肿瘤的目的[30]。 临床中顺铂(DDP)可引起患者耳毒性,使用褪黑素治疗后可降低相应的毒性反应。 体内实验研究表明,褪黑素能够降低DDP 的肾毒性和急性肾损伤[31]。 此外,在人结肠癌细胞实验中,辐射与褪黑素联合治疗能够显著改善该肿瘤细胞对γ 射线辐射敏感性,从而对该肿瘤细胞生长有显著抑制效应并发挥其抗肿瘤作用[32]。 以上研究表明,褪黑素具有潜在的肿瘤治疗效应,褪黑素能够作为初级治疗药物用于肿瘤的辅助治疗,或通过联合用药来增加其抗肿瘤作用。

3 褪黑素在骨肉瘤中的应用机制

目前,骨肉瘤的治疗存在手术治疗致残率高、假体功能差、放化疗毒副作用大、治疗晚期骨肉瘤容易产生药物耐受等问题,且复发率较高,患者的生存质量差,生存率低,而褪黑素在骨肉瘤中的研究为临床中骨肉瘤的治疗打开了新视野。

3.1 褪黑素在骨肉瘤中发挥促凋亡的作用

诱导肿瘤细胞凋亡是褪黑素抗击骨肉瘤发生的重要机制之一。 林晋等[33]发现褪黑素能够通过Survivin 的表达调控骨肉瘤细胞MG63 和U2 的凋亡,降低Survivin 蛋白的活性与提高半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白的活性可发挥促凋亡作用。 另外,骨肉瘤U2 细胞中,褪黑素能够通过将细胞阻滞于G2/M 期,同时上调Fas 蛋白表达来发挥其促凋亡作用[34]。 联合用药时,低浓度的DDP 与褪黑素联合用药可以实现与甲氨蝶呤(MTX)等同的抗肿瘤效应[35]。 褪黑素影响脱乙酰化酶SIRT1 的表达是实现细胞凋亡的重要路径。 SIRT1 主要依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)发挥作用,抑制SIRT1的表达可作为治疗骨肉瘤的一种潜在选择[36]。 另外,褪黑素可诱导骨肉瘤SOSP-9607 细胞凋亡,调控P53 的乙酰化作用降低Bcl-2 的水平,上调Bax 和Cytochrome C 的水平能够阻断SIRT1 信号通路,从而触发内在的凋亡途径[36]。 在对骨尤文氏肉瘤细胞的研究中,褪黑素能够通过上调Fas 死亡受体与其FasL 配体的表达水平,且同时通过Fas/FasL 系统诱导骨肉瘤细胞凋亡[37]。

3.2 褪黑素在骨肉瘤中发挥抗增殖的作用

由于褪黑素受时间调控,因而某些特定的时间点褪黑素的激素水平表达较低时,则伴随着骨肉瘤的高病发率。 假设提高褪黑素的激素水平可以降低骨肉瘤的发病率,即褪黑素对骨肉瘤细胞具有抗增殖作用。 已有多项研究表明褪黑素可调节多种信号通路来发挥抗骨肉瘤作用。 如骨肉瘤细胞SaOS-2 研究中,褪黑素可抑制细胞活性,阻断G1 期细胞周期,诱导细胞凋亡,发挥抗增殖作用,且褪黑素对低浓度DDP 有拮抗作用,而对MTX 或高浓度DDP 有协同作用[38]。 高水平的褪黑素会以时间依赖性方式对骨肉瘤MG-63 细胞具有抗增殖作用,特异性地下调ERK1/2 的磷酸化,将显著下调与细胞周期G1 进程相关的细胞周期蛋白D1 和CDK4 蛋白的表达,以及其G2/M 期有关细胞周期素B1 和CDK1 蛋白的表达来充分发挥骨肉瘤中的抗增殖作用[39-41]。 此外,褪黑素抗增殖的另一重要内在机制为上调P53 的表达,下调C-myc 基因的表达,且其抗增殖作用与丝裂原激活激酶和AKT 信号转导有关。 同时,一些证据表明褪黑素与抑制剂PD98059联合使用对ERK1/2 具有双重阻断作用,且褪黑素本身可以特异性抑制ERK 转变为p-ERK[39]。 同时,褪黑素可以抑制血管内皮生长因子A(VEGFA)中对miR-424-5p 的表达调控,调控肿瘤血管形态,血管原生长因子与周围内皮细胞增殖和迁移。 激活miR-424-5p/VEGFA 轴在肿瘤抑制中起关键作用[42]。

3.3 褪黑素受体在骨肉瘤中的应用机制

褪黑素受体在不同的肿瘤中有着不同的抗肿瘤作用,其受体属于G 蛋白偶联受体超家族,包括的亚型有MT1、MT2、MT3。 人类主要有MT1 和MT2两种亚型的褪黑素受体,MT1(由MTNR1A 编码)和MT2(由MTNR1B 编码)主要负责调节相应的下游效应[43]。 已有的研究认为MT1 对于肿瘤细胞增殖的调节起重要作用,而MT2 主要调节昼夜节律、血管舒张、机体免疫功能等,且MT2 受体广泛分布于成骨细胞、四肢血管和视网膜等。 这些分布位置为褪黑素治疗骨肉瘤奠定了基础[43]。 另外,骨肉瘤与M1 受体密切相关[44],MT1-mRNA 和MT2-mRNA 在骨肉瘤细胞HOS 和MG63 中的表达,为褪黑素在骨肉瘤治疗中的应用提供了研究基础。 此外,大多数MT1 受体在骨肉瘤临床试验中呈强阳性表达。 例如,在骨软骨瘤中,有14.2%的标本MT1 受体呈弱阳性表达[45],表明编码MT1 受体的基因在骨肉瘤的发展过程中被激活,从而表达大量的MT1 受体。

3.4 褪黑素在骨肉瘤转移中的应用机制

临床治疗骨肉瘤最为棘手的问题之一就是骨肉瘤的转移。 研究证明,褪黑素对骨肉瘤细胞浸润与转移有防御作用,并有浓度依赖性,其机制与蛋白激酶A(PKA)和肉瘤基因Src 平行参与介导环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)依赖性基因转录相关[46]。 SOX9 转录因子是褪黑素介导骨肉瘤的关键因子之一,在骨骼生长中发挥着重要作用。 体内实验研究表明,褪黑素能够显著抑制模型小鼠中骨肉瘤的启动和转移,并调节骨肉瘤细胞的上皮-间充质转化(EMT)标记,并下调SOX9 参与的信号通路,从而阻止其发生和转移[47]。 此外,褪黑素还可通过细胞骨架重组、细胞外基质重塑、上皮-间充质转化来抵消血管生成反应,从而抑制骨肉瘤肿瘤细胞的转移与浸润[48]。 在骨肉瘤的转移样本中,Notch1 和Notch2 受体在高度转移的骨肉瘤标本呈高表达[49]。Fas/Fas 配体通路的下调使细胞促凋亡作用减弱并发生骨肉瘤的转移,而Src 和Wnt/β-Catenin 通路也参与其中[49]。 此外,褪黑素的细胞毒性低,并显著抑制细胞的机动性。 如褪黑素可下调骨肉瘤细胞U2OS 中的趋化因子CCL24 的表达水平[50],而CCL24 的表达水平是影响骨肉瘤细胞迁移的关键。细胞迁移和侵袭,因高表达的CCL24 而增强,并因CCL24 的沉默而减弱。 减少细胞外ERK1/2 和JNK1/2 的激活,可下调CCL24 的表达[42]。 降低CCL24 的表达与抑制JNK 信号通路的转导可预防骨肉瘤的浸润[50]。 综上所述,这些结果说明褪黑素可由多种途径和机制发挥抗骨肉瘤的作用。

4 结语

骨肉瘤最常见的骨原发恶性肿瘤之一,其近年来5 年存活率已从20 世纪50 年代的20%上升至55%~70%[1],骨肉瘤晚期患者的生存质量差,多进行姑息疗法。 提高患者生存率与生存质量是临床中治疗骨肉瘤最需解决的问题之一。 尽管临床有许多可用的抗肿瘤疗法,但临床治疗中出现的副作用也是层出不穷。 研究人员试图找到新的药物与治疗方法来克服目前骨肉瘤临床治疗上所面临的问题。 由于骨肉瘤的发病率与褪黑素水平相关,同时该激素在多种肿瘤中的运用有着良好的抗肿瘤作用,因而可作为治疗骨肉瘤的新候选药物或潜在药物。 总的来说,目前,褪黑素单独或与其他治疗药物联合使用可能是骨肉瘤肿瘤治疗的一个很好的选择。 同时,褪黑素治疗骨肉瘤的具体机制尚未完全解开,需要更进一步研究。