非洲猪瘟疫苗和病原学诊断技术研究进展

杨佳萍，寇美玲，，谢佳芮，苗海生

（1.施甸县畜牧兽医中心，云南施甸 678200；2.云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家猪和野猪引起的一种急性、热性和高度致死性传染病。该病发病快、病程短，病死率可高达100%，为世界动物卫生组织（OIE）规定的须通报动物疫病，也是我国重点防范的一类动物疫病。2018 年8 月首次发现ASF 疫情后，我国采取了扑杀疫区内生猪等一系列紧急防控措施，截至2021年5 月底，全国报告发生ASF 疫情共191 起，累计扑杀生猪121.01 万头，给我国生猪养殖业造成了巨大损失[1-3]。由于ASFV 具有庞大的基因组结构和复杂的免疫逃逸机制，使得疫苗开发极具挑战性，至今仍无安全有效疫苗上市[4]。在猪群没有进行有效疫苗接种的前提下，ASFV 抗体产生存在一定的滞后性，抗体检测易出现假阳性且无法判定现症感染[5]。因此，建立快速、可靠的病原学诊断方法对于该病早期的防控和扑灭具有重要意义。本文综述了当前国内外ASF 疫苗和病原学诊断技术的研究进展，以期为今后ASF 疫苗研制和诊断技术选择提供参考。

1 疫苗研究

1.1 灭活疫苗

灭活疫苗是通过物理或化学过程使病原微生物丧失感染性与毒性，但仍保留免疫原性的一类疫苗。ASF 刚被发现时，研究人员就以灭活疫苗为主要研制方向，但迄今为止，所研制的各种灭活疫苗均不能抵御ASF 强毒株的攻击，不能提供有效保护[6]。Blome 等[7]利用新型佐剂PolygenTM或Emulsigen®-D 研制出的灭活疫苗，虽然能诱导机体产生针对性的特异抗体，但所有实验动物均无法抵御ASFV 攻击，不能提供有效的免疫保护作用。因此，该类疫苗当前已不作为研究的重点方向。

1.2 减毒活疫苗

减毒活疫苗是通过分离鉴定天然致弱毒株或使用人工手段产生致弱毒株，经特殊培养后所制备的活疫苗。与灭活疫苗相比，减毒活疫苗能够诱导强烈持久的免疫应答，同源保护率高，但毒力有自然返强的可能，存在诸多生物安全隐患。根据毒株来源不同，可将ASFV 弱毒活疫苗的研制分为传统减毒活疫苗和重组减毒活疫苗两类。

1.2.1 传统减毒活疫苗 20 世纪60 年代，西班牙和葡萄牙暴发ASF 疫情后，有研究者进行了田间试验，发现弱毒活疫苗能为猪只提供同源保护及部分异源保护，但接种猪出现了肺炎、流产等多重感染，且增加了ASFV 再次感染的风险[8-9]。后有学者利用天然分离的致弱毒株（OURT88/3 或NH/P68）制备减毒活疫苗。这类疫苗能对同源ASFV产生有效的免疫保护，但对异源ASFV 保护率低甚至没有保护，且存在毒力自然返强、临床副作用严重等问题[10-11]。近年来，随着新分子生物学技术的进步，尤其是基因编辑技术的突破性进展，这种基于自然毒株弱化的方式已逐渐被淘汰。

1.2.2 重组减毒活疫苗 科研人员利用基因编辑、同源重组等分子生物学技术将ASFV 毒力基因敲除，以降低ASFV 毒力，致力于研制安全有效的重组致弱活毒株疫苗。Borca 等[12]发现：从Georgia07 分离株（ASFV-G）中删除一个先前未经鉴定的基因I177L会导致其毒力完全衰减。肌肉注射缺失I177L基因ASFV-G-ΔI177L毒株的动物，在28 d 的观察期内临床症状正常，且病毒血症滴度低，没有病毒脱落，并出现强烈的特异性抗体反应；重要的是，当与强毒力亲本菌株ASFV-G 竞争时，即使在低剂量免疫的情况下，它们也能提供保护，在安全候选疫苗中极具潜力，为ASFV 减毒活疫苗的研制提供了新的技术和研究思路。Chen等[13]以我国第一株ASFV 分离株HLJ/2018 为骨架，利用同源重组技术构建了一系列不同基因缺失的重组病毒，通过在猪体内进行系统的致病力、免疫原性和免疫保护性试验，遴选出一株7 个基因缺失的病毒（HLJ/18-7GD）；通过对其安全性、有效性进行试验研究发现，该毒株可对强毒的致死性攻击提供有效免疫保护，不产生病毒血症，且不存在毒力返强风险；该毒株对育肥猪生长发育和接种母猪繁殖性能无不良影响，对田间商品猪存活保护率在80%以上，是当前所研发的疫苗中保护性和安全性兼具的疫苗，具有良好的应用前景。但鉴于能繁母猪生产利用周期长，该疫苗接种后的安全性、有效性等有待进一步观测、评估。

1.3 基因工程疫苗

基因工程疫苗是基于选择合适的ASFV 抗原基因进行开发的，与传统灭活疫苗和减毒疫苗相比，基因工程疫苗成本低且安全性高，可以诱导产生ASFV 特异性抗体及相应的细胞免疫反应，但面对强毒株攻击的有效保护作用不强。目前基因工程疫苗研究主要集中在p72、p30、p54、CD2v等抗原基因及其编码蛋白，包括亚单位疫苗、DNA 疫苗、病毒活载体疫苗。

1.3.1 亚单位疫苗 亚单位疫苗是利用特异性ASFV 基因和蛋白的表达来产生特异性免疫应答的一类疫苗。其研究策略主要是将具有中和表位的ASFV 保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，然后将产生的蛋白质或多肽递呈给抗原递呈细胞，以诱导产生高滴度的抗ASFV 中和抗体。与其他疫苗相比，亚单位疫苗较安全，但保护性不强，目前已研发的亚单位疫苗还无法抵御强毒株的攻击[14-15]。研究表明，针对p72和p54基因所表达的蛋白对病毒吸附具有抑制作用，而针对p30所表达的蛋白则对病毒内化具有抑制效果，说明这些功能性蛋白在针对感染所产生的体液免疫应答中起着关键作用，但经p30或p54基因疫苗免疫的猪在面对急性ASF时均没有保护作用[16]。Netherton 等[17]利用腺病毒和痘苗病毒作为载体，表达18 种能被ASFV 特异性淋巴细胞识别的抗原，结果发现未能提供有效保护，但接种猪血液中的病毒滴度明显低于未免疫猪。Jancovich 等[18]通过干扰素-γ 酶联免疫吸附点试验测定了猪免疫淋巴细胞对单个重组蛋白和ASFV的反应。利用DNA 抗原病毒将47 种ASFV 蛋白的重组痘苗病毒疫苗免疫猪后筛选ASFV 的保护性抗原，结果筛选出p30 和p72 蛋白能有效刺激机体体液免疫及细胞免疫应答；虽然免疫猪出现了与急性ASF 一致的临床和病理体征，但与未免疫猪相比，其血液和一些淋巴组织中的病毒基因组水平显著降低。因此，研究和开发更多的ASFV 保护性抗原或新型免疫佐剂，刺激机体产生免疫应答效力是当前研制ASFV 亚单位疫苗的关键。

1.3.2 DNA 疫苗 DNA 疫苗是通过将编码病毒主要抗原的基因克隆入真核表达载体后，直接导入机体内，在宿主细胞内完成转录翻译后产生抗原蛋白，从而激活宿主特异性的体液免疫和细胞免疫。DNA 疫苗制备简单、成本低廉，可同时表达多种抗原且无毒力逆转危险，但其中和病毒能力不强，面对ASFV 强毒株的攻击不能提供有效保护[19]。Argilaguet 等[20]将CD8+T 细胞作为ASFV 保护的关键元件，设计了一个新的质粒结构pCMV-UbsHAPQ，编码3 种病毒决定因子（sHA、p54 和p30）与泛素融合，旨在改善Ⅰ类抗原，并增强诱导CTL 的效应。结果显示，在不存在抗体的情况下，该质粒结构能成功诱导免疫猪特异性的T 细胞反应，且可保护一部分免疫猪免受ASFV 的致命挑战。Sunwoo 等[21]用ASFV 质粒DNA（CD2v，p72，p32，+/−p17）和重组蛋白（p15，p35，p54，+/−p17）混合后对猪进行3 次接种，以测试联合DNA-蛋白疫苗是否能抵抗ASFV Armenia 2007 株的攻击，结果发现免疫猪虽然产生了特异性抗体，但缺乏中和病毒的能力，而且被观察到在体外ASFV 感染力增强。因此，DNA 疫苗要达到有效免疫保护的目标仍需要进一步深入研究。

1.3.3 病毒活载体疫苗 病毒活载体疫苗是利用基因工程技术，将致病微生物免疫保护性抗原的基因，导入到载体病毒或细菌的非必须区而构建重组病毒，经培养后制备的疫苗。该类疫苗在对抗人类易感病毒或动物易感病毒中均得到了广泛应用，并取得了良好的应用效果。Lokhandwala等[22-23]评估了多种腺病毒载体新型ASFV 抗原的免疫原性，将重组腺病毒配制在佐剂中混合免疫商品猪，发现免疫猪大多数能够诱导安全强特异性抗体和IFN-γ 细胞分泌。但是，这些研究还未涉及免疫保护试验和安全性评估，其保护效力和安全性仍有待进一步验证。Murgia 等[24]利用α 病毒载体平台传递表达ASFV 抗原的复制粒子（RPs）抗原，分别构建了表达ASFVp30（RP-30）、p54（RP-54）和pHA-72（RP-sHA-p72）的抗原载体，并且测试了3 种载体抗原在Vero 细胞中的表达和在猪身上的免疫原性。结果显示，RP-30 在Vero 细胞中表达最高，在猪中免疫原性最高，其次是RP-54和RP-sHA-p72。该研究通过用ASFV 天然减毒株OURT88/3 增强免疫RP-30 接种猪，证实了将减毒活病毒增强策略和载体表达抗原构建相结合可扩大对ASFV 表位的识别。Lokhandwala 等[25]再次使用BioMize 和ZTS-01 两种佐剂对猪进行鼻内刺激免疫，通过该方法来评估两种不同“鸡尾酒”佐剂的保护效果。结果显示：BioMize 佐剂可诱导猪产生强烈的抗体反应，但80%疫苗接种猪死于强毒株Georgia2007 的攻击；相比之下，ZTS-01 佐剂诱导产生的抗体反应较弱，但约56%猪能够抵抗强毒株Georgia2007 的攻击，在攻毒后17 d 内表现的临床症状轻微，且无病毒血症。ASFV 活载体疫苗的研究还在持续进行中，载体毒株的选择，保护性抗原的选择和设定以及佐剂的优化是该类疫苗的重点研究方向。

2 病原学诊断技术

目前没有商品化的疫苗可用于ASF疫情防控，因此建立快速、可靠的病原诊断方法，对于该病早期预警和科学防控具有重要意义。病原学诊断技术是针对病原体本身采取的检测方法，能够在ASF暴发早期检测出动物体内是否带毒。相较于血清学检测，病原学检测能更快速、可靠地确定病原体。检测人员也可根据临床发病情况和实验室诊断条件选择合适的检测方法。例如，快速鉴别诊断、核酸定量可采用实时荧光定量PCR（qPCR）和微滴数字PCR（ddPCR）类核酸检测技术，基层现场快速检测可使用环介导恒温扩增技术（LAMP）、重组酶聚合酶扩增技术（RPA）类等温扩增检测技术，或成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白技术（CRISPR/Cas）等。具体适用场景可根据自身的人员情况、仪器设备和试验条件选择合适的检测方法。

2.1 qPCR

qPCR 方法是将光谱技术引入到PCR 反应中，通过荧光信号的强弱变化定量测定特异性扩增产物的量，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的一种核酸定量检测技术。该技术与常规PCR 相比，去掉了琼脂糖凝胶电泳，速度更快，具有特异灵敏、定量准确、操作简便以及样品污染小和自动化程度高等优点[26]。OIE 及国家ASF 参考实验室均公布了标准检测方法，为ASF 诊断提供了技术支撑。此外，崔贝贝等[27]以ASFVK196R基因为靶标，建立了快速检测 ASFV 的TaqMan qPCR 检测方法，证实该方法特异性强、灵敏度高，对检测样品和环境要求相对较低，且与其他多种猪病病原不存在交叉反应，适合大批量样品检测。吴亚楠等[28]参照GenBank 登录的ASFVP72相关基因序列，设计合成1 对特异性引物与1个TaqMan 探针，通过反应条件和反应体系优化，建立了快速检测ASFV 的TaqMan qPCR 方法。验证结果显示，该试验所建立的方法具有很好的灵敏性、特异性和重复性。目前qPCR 方法是筛查和确诊ASFV 感染的主要方法，许多县市级动物疫病预防控制中心和屠宰场均配备了相应的仪器设备，具备了检测ASFV的能力。但是，qPCR 产物易污染环境和试剂，需要严格划分样品处理、试剂配制和扩增区域，一旦操作不当就会出现假阳性，必要时还需进行普通PCR 验证和序列测定。

2.2 ddPCR

ddPCR 结合了液滴微流控芯片与数字PCR 技术，是一种新的绝对定量技术。该技术不仅继承了数字PCR 技术高通量、高灵敏度、低消耗等优点，而且解决了传统数字PCR 芯片结构复杂、加工困难、成本高等问题。它不依赖于标准曲线，在低浓度的核酸含量下也可高度灵敏和准确地对核酸拷贝数进行绝对定量，在核酸分子的绝对定量领域具有极大潜力[29-30]。原霖等[31]建立的ddPCR 方法，最低检测限可达0.8 copies/μL，检测结果与qPCR 相符，且敏感性高于qPCR，因此更加适用于ASFV的早期检测以及泔水、饲料、猪肉产品中微量核酸的检测，对于防控和开展流行病学溯源工作都具有重要意义。严礼等[32]根据ASFV 核酸的2 段保守序列（VP72和K205基因），合成3 对引物和探针，在摸索条件、优化方法后，比较方法的线性、特异性、灵敏性和重复性。结果表明，这3 种方法重复性好、特异性强，能满足快速定量检测的要求，且不与常见的2 种猪病毒发生交叉反应，适用于猪肉及其制品中的ASFV 检测，有利于在源头、食品加工、食品销售等各个环节，加强对生鲜猪肉及各类猪肉制品的检测，切实降低潜在风险。由于该检测方法所需要仪器设备价格高昂，目前主要在高级别实验室使用，尚未能在基层实验室推广应用。

2.3 LAMP

LAMP 是日本Notomi[33]发明的一种基于链置换DNA 聚合酶的恒温核酸扩增方法。该方法不需要PCR 中的热变性、温度循环、电泳成像等过程，只需简单的恒温设备即可完成基因扩增和产物检测，且整个扩增反应时间一般少于60 min。田纯见等[34]利用高度保守的非结构DNA 聚合酶G1211R基因，制备质粒标准品，建立了实时荧光LAMP方法，检测ASFV 核酸灵敏度达到10-5以上，相当于每个反应体系可以检出21 pg 病毒DNA，优于qPCR 检测结果（10-3），且重复性和特异性良好，与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及昆虫核酸等无交叉反应，有利于不同基因型毒株检测和出入境快速筛查。王林等[35]根据 ASFVP72基因保守区域设计特异性引物，优化引物浓度、反应温度、反应时间，建立了一种基于SYTO9 荧光染料的实时荧光LAMP 快速检测方法。该方法可在40 min内完成检测反应。LAMP 技术与常规PCR 方法相比具有敏感性高，操作简单、快速，对仪器设备要求低，可实现现场、可视化检测等优点，但常因操作不当造成产物污染试剂，再次检测时易出现假阳性，并且单份样品检测成本较高，因而目前尚未大面积推广。

2.4 RPA

RPA 是一种由重组酶、单链DNA 结合蛋白和链置换Bsu 聚合酶参与的恒温扩增新技术。该技术在体外进行核酸扩增时不需要加热，在23～45 ℃下即可完成对双链DNA 的解链处理并进行循环扩增，不需要昂贵的控温设备，反应时间只需5～20 min，特异性强、灵敏度高，与qPCR 相比更简单、经济、快速，适用于实验室外及资源匮乏地区的现场检测[36]。张皓淳等[37]选择pcDNA12L 和pcDNA13L作为标准质粒，建立了RPA 等温检测方法，检测结果体现出RPA 具有较好的特异性和敏感性，与PCR 检测方法相比检测下限提高程度明显，具有一定运用优势。吴映彤等[38]基于MGF360-12L基因序列，设计并合成引物，建立了RPA 等温检测方法。结果显示：该方法35 ℃恒温反应30 min 即可实现对目的片段的稳定扩增；检测限可达到103个拷贝，同普通PCR 方法检测限一致，但反应时间仅为普通PCR 的1/4；与其他猪病毒无交叉反应，特异性较强；操作简单、反应快速、检测成本低，可满足疫病快速现场检测的需求。目前该检测方法在推广中面临的瓶颈问题主要是需要进行专门的核酸提取，导致反应快速的突出优势并未完全展示，另外还存在检测成本较高和稳定性差的问题。

2.5 CRISPR/Cas

CRISPR/Cas 核酸检测技术是近年来发展起来的一项新的检测技术，一经问世便得到了广泛关注。该技术由CRISPR RNA（cr RNA）和Cas 蛋白组成，是原核生物的“免疫系统”，其中crRNA 与靶序列互补，可引导Cas 蛋白进行序列特异性识别和切割，对入侵的核酸分子进行切割使其降解，从而释放出信号达到检测效果。CRISPR/Cas 核酸检测技术可提供快速、灵敏、现场、特异的定量分析与多重分析，不需要繁琐的操作处理及昂贵的辅助仪器，仅通过荧光、电化学及可视化等方法进行信号读取，就可实现病原微生物的精准检测、监测与控制，是目前ASFV 检测的热门方向[39]。Wang 等[40]开发了一种基于CRISPR/Cas12a 技术和横向流检测（CRISPR/Cas12a-LFD）的快速、敏感、无仪器的ASFV 检测方法。该方法所检测样本结果与qPCR检测一致，但检测时间比qPCR 更短，且与其他猪DNA 病毒无交叉反应，比较适用于现场诊断。He等[41]将CRISPR-Cas 检测技术与基于荧光的护理点（POC）系统结合起来，建立了一个高通量、全液相的等温检测系统。该方法易操作、特异性强、敏感度高，且不需要专家指导。目前该技术仍然处于实验室研发阶段，未见有商品化的产品推出。

3 展望

面对ASF 疫情，我国虽然采取了封锁隔离、扑杀疫点内生猪等一系列紧急防控措施，但疫情仍时有发生，给我国生猪养殖业造成了巨大损失。要阻断疫病的传播，除了做好生物安全防控措施外，疫苗和准确的早期诊断是亟需的防控手段。近年来，ASF 疫苗的研究虽取得了较大进展，但由于ASFV具有庞大的基因组结构和复杂的免疫逃逸机制，使得当前所研发的疫苗株接种猪后普遍存在免疫保护效果不佳、毒力返强、副反应严重等问题。基于以上对疫苗研究现状的分析，在众多的疫苗研发策略中，目前只有利用天然分离或敲除ASFV 毒力基因的致弱毒株开发重组减毒活疫苗具有较好的利用前景，尤其是ASFV-G-ΔI177L与HLJ/-18-7GD 候选疫苗株，被认为是短期内保护效果最理想的疫苗株，但安全性和有效性仍有待进一步研究。随着对ASFV 基因组结构、免疫逃逸机制的深入研究和CRISPR/Cas9 等新型分子生物学技术的兴起，相信安全、高效、特异性强的ASF 疫苗面世将指日可待。

目前在没有有效疫苗免疫的前提下，建立快速、可靠的早期病原诊断方法对于ASF 疫情确认和控制同样至关重要。近年来，ASFV 检测技术发展迅速，ddPCR、LAMP、RPA、CRISPR/Cas 等新兴诊断技术相继建立，与传统检测方法相比，这些新的检测技术操作更简单，检测速度更快，特异性更强，但其检测能力与适用场景尚存在一定不足，还需要进一步完善。随着生物学研究的不断发展，未来ASFV 检测的研究方向应建立在成本低廉、简单便捷、高效准确、集成化的基础上，或可将多种诊断方法联合应用，各取所长。