高毒力高耐药肺炎克雷伯菌的研究进展

王海日罕，多丽波

(哈尔滨医科大学附属第二医院检验科，黑龙江 哈尔滨 150086)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)属于肠杆菌目，是一种常见的条件致病菌和医院感染菌，可引起肺炎、尿路感染、菌血症和化脓性肝脓肿等多种感染。根据毒力和致病特点可将KP分为“经典”肺炎克雷伯菌(classicalKlebsiellapneumoniae, cKP)和高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumonia, hvKP)。可导致医院感染是cKP的主要特征之一，通常感染有免疫缺陷或免疫低下的人群，其携带的毒力基因较少，致病力较弱，但对抗菌药物可以表现为高水平的多重耐药，已成为世界卫生组织重点关注的对象。而hvKP常表现为社区获得性感染，且越来越多地引起医院感染，通常更易造成健康人群发病。1986年hvKP在中国台湾首次被发现，在没有任何肝胆危险因素的社区来源患者引起化脓性肝脓肿。研究者很快发现，这种KP具有高侵袭性，能向远处转移，最常见的转移部位包括眼、肺、肝、全身软组织和中枢神经系统，临床上称之为侵袭综合征，且预后差，病死率高，治愈后也可能有较重的后遗症。虽然hvKP最初主要在东南亚发现，但现在全世界报道的病例越来越多，包括欧洲和美国，而中国是hvKP感染高发地区[1]。此外，hvKP在过去对抗菌药物非常敏感，然而这些菌株也开始表现为高度耐药，因此hvKP的临床环境正在发生巨大的变化，对治疗提出了新的挑战。

1 hvKP的鉴定和毒力因子

1.1 鉴定 目前对于hvKP的定义尚无统一标准，过去常采用拉丝试验鉴定，即当一个菌落可以通过接种环拉伸至少5 mm时，该菌株被定为hvKP。但是，并非所有的hvKP都具有高黏液表型，且并非所有的高黏液表型菌株都是hvKP。随着研究的进展，目前常见以下几种定义方法：(1)临床上具有侵袭综合征表现；(2)拉丝试验阳性株；(3)荚膜血清型K1/K2；(4)毒力基因RmpA/RmpA2阳性株；(5)毒力基因aerobactin阳性株。满足上述两条及以上即可判定hvKP感染。

1.2 毒力因子

1.2.1 荚膜(capsule, CPS) CPS覆盖在细菌的表面起保护作用，是KP重要的毒力因子。可以通过抗吞噬、抵抗多种抗菌肽、抑制补体和宿主炎症反应来增加KP的生存能力和传播能力，从而造成侵袭性感染。

1.2.1.1 CPS基因构成 CPS主要成分是一种酸性脂多糖，由3～6个糖重复单元组成，并通过Wzy聚合酶依赖途径合成。CPS编码基因位于染色体操纵子cps上，大小为12～30 kb，含有16～25的基因，参与CPS合成、聚合、装配等，cps基因簇中wza、wzb、wzc、wzi、gnd、wca、cpsB、cpsG和galF参与荚膜合成；wzy(也称为orf4)、cpsB和cpsG参与荚膜聚合物的合成，cpsB和cpsG分别通过编码甘露糖-1磷酸鸟嘌呤转移酶和磷酸甘露糖突变酶，参与荚膜多糖的聚合反应；wza、wzc、orf5和orf6参与荚膜表面组装；wzi基因编码一种表面蛋白，有助于荚膜黏附在外膜上[2]。

1.2.1.2 CPS调控基因 CPS合成受多种调控基因调控，研究较多的主要有黏液表型调节因子A(regulator of the mucoid phenotype A,rmpA)和黏液相关基因A(mucoviscosity-associated gene A，magA)，以及转录调控因子RcsAB。

rmpA于1989年首次被发现，大小为636 bp，编码137个氨基酸的蛋白质，调控荚膜合成，促进黏液表型形成并增强菌株毒力。rmpA2于1993年被发现，与rmpA有80%的同一性，大小为411 bp，编码212个氨基酸的蛋白质。编码rmpA/rmpA2的基因有三个：rmpA既可位于染色体(c-rmpA)，也可位于质粒(p-rmpA)，而rmpA2只位于质粒(p-rmpA2)。Cheng等[3]的研究显示KP CG43，p-rmpA和p-rmpA2均促进荚膜生成。而在另一项报道中，Hsu等[4]将NTUH-K2044菌株和c-rmpA、p-rmpA、p-rmpA2基因缺失株分别进行比对，表明仅p-rmpA会增强荚膜多糖合成基因的表达和CPS生成。因此，rmpA在毒力形成中的作用仍需进一步研究证实。虽然92%～100%hvKP呈rmpA阳性[1]，但rmpA与高黏液表型的联系并不是绝对的，一些rmpA阳性菌株缺乏高黏液表型且毒力低，可能是由于在无c-rmpA的情况下，rmpA和rmpA2基因同时发生突变引起[5]。

magA于2004年初次报道，大小为1.2 kb，编码408个氨基酸的蛋白质，作为血清型K1的cps基因簇中的聚合酶基因wzy负责K抗原的合成，形成黏性的胞外多糖网状结构，具有抗吞噬、抗血清补体杀菌作用，现将magA重命名为wzy_K1[6]。

Rcs磷酸化系统(Rcs phosphorelay system)是一种信号转导系统，包括RcsA、RcsB、RcsC和RcsD。RcsAB形成一种非典型的双组分调节系统，可以调节荚膜多糖的生物合成，并与KP的毒力相关。Peng等[7]比较了NTUH-K2044以及RcsAB敲除和补充菌株，结果显示NTUH-K2044ΔRcsAB株的毒力、生物膜形成和CPS水平下降。而后在NTUH-K2044ΔRcsAB的质粒上引入RcsAB片段，显示菌株的毒力、生物膜和CPS合成得到部分恢复。表明RcsAB基因可能影响KP的CPS形成和毒力。另外，RcsAB还通过直接与galF启动子DNA结合，正向调节galF基因的转录，进而影响KP的CPS形成。

另外一项新研究[8]发现转录调节因子kvrA、kvrB也参与激活染色体上荚膜合成基因的转录，而敲除这两个基因的ΔkrvA、ΔkrvB菌株荚膜产量减少了40%，及其毒性也不如野生型。

1.2.1.3 CPS类型(Capsule type K) 因遗传差异而导致的不同多糖变体被称为K抗原，可以分为多种荚膜类型。据统计，目前根据荚膜多糖可以将KP至少分为82个血清型，其中与hvKP相关常见的血清型依次为K1、K2、K5、K20、K54和K57[9]，而K1与K2型通常被认为是引起侵袭综合征的关键毒力因子。尽管K1/K2型约占hvKP的70%[10]，但荚膜类型并不能完全解释高毒力。研究[11]显示，将毒性较弱的菌株荚膜相关基因敲除，并替换为来自K1的同源基因后，用于荚膜合成的同源基因未能表现出相同功能，并且根据基因的同源性不同程度地降低了毒力，表明荚膜并不是毒力的唯一因素。

1.2.1.4 CPS类型与多位点序列分型(multi-locus sequence typing,MLST) KP的基因组结构多样，可分为多个谱系，因此临床上通常采用MLST对其进行分类，通过扩增KP的7对管家基因，与MLST数据库进行比对，得到菌株相对应的序列类型(sequence type, ST)。其中，hvKP最常见的序列分型为ST23型，也是导致肝脓肿的主要类型，而cKP最常见的序列分型为ST11型[12]。研究[13]表明，来自肝脓肿患者的KP菌株中有57.8%属于ST23型，而这些ST23型KP中96.2%是K1血清型。K1血清型与ST23相关的原因尚不清楚。同时，K2血清型的hvKP菌株具有遗传多样性，一项研究[14]在血清型K2分离株中发现了8种不同的序列类型：ST86(46%)、ST65(42%)、ST66、ST373、ST374、ST375、ST380和ST434。值得注意的是，K1 ST23 型hvKP与化脓性肝脓肿相关，而K2 ST65型 hvKP与各种侵袭性感染相关[15]。

1.2.2 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) LPS是革兰阴性菌细胞壁主要成分，也被称为内毒素，能够引起患者发热、白细胞反应、出血倾向等。从外到内依次为O抗原、核心多糖、脂质A，每个组分具有不同的功能[2]。O抗原可阻止补体C1q和C3b与细菌结合，阻止细菌裂解，在KP中有9种O抗原，最常见的是O1。核心多糖具有抗吞噬作用，有助于细菌定植。脂质A有助于抵抗宿主天然免疫，尤其是抵抗抗菌肽作用。cKP和hvKP菌株均具有完整的LPS，目前尚未发现hvKP的LPS产生了独特的结构特征使菌株毒力增强。

1.2.3 黏附素(adhesin) 黏附素有助于KP定植，可以分为菌毛和非菌毛，目前发现的主要有1型菌毛(T1P)、3型菌毛(T3P)、Kpc菌毛、KPE-28菌毛、ECP和CF29K等，其中最重要的是T1P和T3P[16]。T1P由FimH编码，介导细菌与宿主细胞(甘露糖)结合，从而导致泌尿道感染。T3P由MrkABCD编码，MrkA直接结合到非生物表面，介导KP黏附到气管内导管，MrkD结合到胶原质或支气管细胞衍生的细胞外基质表面，均与肺部感染相关。hvKP中，这些菌毛与非菌毛型黏附素均促进生物膜的形成，有助于细菌定植与侵袭，从而使菌株毒力增强。

1.2.4 铁获取系统 铁是人体和细菌生长发育的关键元素，由于Fe3+在生理条件下不溶解及人体对Fe3+、Fe2+的限制，导致组织和血清中游离铁的含量极低。铁的获取通常受到一组相对协调的蛋白质的限制，而在人体感染期，这些蛋白会在一种被称为营养免疫的过程中更加严格的限制生物可利用的铁[17]。因此，入侵人体的病原体需要编码高亲和力的铁获取系统来对抗宿主的营养免疫。

铁载体是细菌合成并分泌的小分子物质，在细胞外铁载体以极高的亲和力与铁结合，并将铁转运回细胞内，为细菌提供生长所需的铁。一项铁载体定量检测显示，在铁缺乏的培养基或人的腹腔积液中，hvKP产生的铁载体比cKP高6～10倍[18]。当某菌株铁载体总量达30 g/mL时，可增加小鼠感染模型的致死率，预示着该菌株为hvKP，这可能是hvKP获得高毒力的机制之一。目前已知有4种铁载体，包括肠杆菌素(enterobactin)、耶尔森菌素(yersiniabactin)、沙门菌素(salmochelin)和气杆菌素(aerobactin)。研究[19]表明，耶尔森菌素、沙门菌素和气杆菌素在hvKP中更常见。

1.2.4.1 气杆菌素 气杆菌素由iucABCD编码，是一种氧肟酸盐与羧酸盐混合型铁载体，位于大多数cKP菌株中不存在的大毒力质粒(pLVPK)上[20]，因此在cKP菌株中极少表达气杆菌素，但在大多数hvKP中都存在。其具有较低的铁亲和力，但占铁载体总量的90%以上。Russo等[18]敲除iuc基因后，发现hvKP1ΔiucA铁载体总量减少94%以上，其离体生长存活率也明显低于hvKP1。且感染hvKP1ΔiucA的小鼠死亡率明显低于hvKP1组。分析来自香港、新加坡和台湾的47株K1型KP时，所有具有50%致死剂量<102菌落形成单位的菌株均携带气杆菌素[21]。这些数据支持了气杆菌素与hvKP毒力相一致，有望成为准确检测hvKP的生物标志物。

1.2.4.2 其他铁载体 肠杆菌素由超过90%的肠杆菌目细菌产生，是一种典型的邻苯二酚盐型铁载体蛋白，对铁的亲和力最高，但受到宿主脂质转运蛋白2(Lcn2)抑制，该蛋白能与携带铁的肠杆菌素结合，并阻止其返回细胞，以阻碍细菌获取铁。肠杆菌素由entABCDEF编码，其过度表达可使细菌携带更多的铁载体进而获得更多生命所需的铁，从而增强细菌毒力。沙门菌素是一种邻苯二酚型铁载体，是经c-葡糖基修饰的肠杆菌素，对铁亲和力较高，由iroBCDN编码，与气杆菌素编码基因位于同一个大毒力质粒上。耶尔森菌素首次在耶尔森菌中发现，是一种主要为酚盐和羧酸盐的混合型铁载体，具有中等水平的铁亲和力，由ybt编码合成。耶尔森菌素和沙门菌素能够抵抗脂质转运蛋白2，有助于hvKP获取更多的铁，从而增强细菌毒力。

1.2.5 PEG-344 Bulger等[22]通过转录组序列技术发现了一种新型毒力因子(将其命名为PEG-344)，位于hvKP1毒力质粒上，在hvKP菌株中广泛流行。该研究敲除PEG-344基因，比较hvKP1及hvKP1ΔPEG-344在各种培养基中以及在小鼠感染模型中的生长和存活情况。与hvKP1相比，在人腹腔积液中观察到hvKP1ΔPEG-344的存活率下降，但对补体杀伤能力有相似的抵抗力。受到hvKP1ΔPEG-344攻击的小鼠的死亡率较低，且死亡时间也较晚。PEG-344可能充当内膜转运蛋白，可以转运腹腔积液中存在的未知生长因子。Russo等[23]从北美洲和英国收集了85株hvKP和90株cKP菌株，显示PEG-344作为标志物鉴定hvKP的准确度、灵敏度和特异度分别为97%、99%、96%。表明PEG-344似乎是hvKP特异的，因此具有快速鉴定hvKP的潜在用途。

1.2.6 CRISPR_CAS系统 成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其相关序列(CRISPR-associated sequences,CAS)组成的CRISPR_CAS系统于1980年发现，是广泛存在于细菌和古细菌中的一种适应性免疫调节系统，经CRISPR-RNAs指导抵御入侵的核酸为细菌和古细菌提供了对病毒和质粒的适应性免疫力[24]。CRISPR_CAS系统与细菌毒力和耐药有关，但具体机制不详。宋国滨等[25]收集了61株KP，研究证明CRISPR_CAS系统阳性菌株的毒力基因rmpA、aerobactin、Kfu检出率为81.8%，alls、wcaG、magA检出率为45.5%，明显高于CRISPR_CAS系统阴性菌株，与杜芳玲等[26]的研究结果一致。

1.2.7 其他毒力因子 还有一些尚未被研究透彻的毒力因子，如wcaG，编码荚膜岩藻糖合成，能够抗吞噬；铁离子获取因子kfu，是磷酸糖磷酸转移酶系统中的一种成分，广泛存在于hvKP菌株中；alls基因可使携带菌株将尿囊素厌氧同化作用作为其生长繁殖的唯一碳源、氮源和能量来源，因而与hvKP的致病能力密切相关。这些因子的致病机制还有待进一步研究。

2 高耐药和高毒力的重叠

在hvKP出现后的最初几十年，除了对氨苄西林天然耐药外，hvKP对抗菌药物广泛敏感。随着广谱抗菌药物广泛大量应用，临床开始出现多重耐药(multidrug resistance, MDR)、广泛耐药(extensively drug-resistence, XDR)，甚至于泛耐药(pan-drug resistance, PDR)的KP。产超广谱β-内酰胺酶、产头孢菌素酶及耐碳青霉烯类KP的陆续出现，使得高耐药KP成为医院感染的重要致病菌，而高毒力、高耐药的KP更加成为目前临床关注的重点。2020年，Liu等[27]在北京两所医院进行了一项回顾性研究，显示43.1%的hvKP为MDR或XDR。

2.1 产超广谱β-内酰胺酶hvKP(ESBLs-hvKP) ESBLs(如CTX、SHV、OXA和TEM)是一种经修饰的广谱β-内酰胺酶，由革兰阴性杆菌产生、质粒介导的丝氨酸蛋白衍生物，可水解青霉素、单酰胺类药物和第一、二、三代头孢菌素及第四代头孢菌素(在某些情况下)。1992年，Vernet等[28]收集法国190株ESBLs阳性KP菌株，气杆菌素和高黏液表型分别占3.7%、7.0%，而且有2.0%的菌株同时具有双毒力因子。2008年，Su等[29]在台湾三军总医院报道了一株产ESBLs的hvKP菌株。2014年，Liu等[30]在中国北京朝阳医院发现了几株引起血流感染的ESBLs-hvKP菌株。2020年，Liu等[27]收集了79株hvKP，显示39.2%表达ESBLs。

2.2 产头孢菌素酶hvKP(AmpC-hvKP) AmpC是由革兰阴性杆菌产生的又一类重要的β-内酰胺酶，AmpC高水平的表达，与ESBLs具有相同的作用，还可以水解头霉素(如头孢西丁和头孢替坦)。部分KP菌株，包括hvKP，获得了含有AmpC酶基因的质粒。2018年，Xu等[31]分离出一株K1 ST23型hvKP，全基因组测序分析表明，该菌株同时携带多种毒力基因和耐药基因，其中包括AmpC酶DHA基因。同年，Xie等[32]在对一株K1 ST23型hvKP进行全基因组测序表明，该菌株基因组同时包含耐药质粒和毒力质粒，在耐药质粒上发现了DHA-1基因。

2.3 耐碳青霉烯类hvKP(CR-hvKP) 碳青霉烯类抗生素可用于治疗产ESBLs和产AmpC的菌株，曾被称为治疗革兰阴性菌感染的最后一道防线。碳青霉烯类抗生素越来越多的用于治疗产ESBLs细菌，逐渐出现耐药性，KP成为最常见的耐碳青霉烯类肠杆菌。CRKP意味着泛耐药，治疗方案有限，患者病死率高。而CR-hvKP同时具有毒力高、耐药广、传播强的特点，临床治疗失败概率大，容易发生医院感染，目前已有报道显示CR-hvKP在医院引起暴发感染。碳青霉烯酶[例如，KPC(A类)、NDM、VIM和IMP(B类)、OXA(D类)]是肠杆菌目对碳青霉烯类耐药的重要机制。2015年，Yao等[33]报道33例感染CRKP的患者分离出7株hvKP，且其中有6株产KPC-2。2016年，Zhang等[34]报道了浙江省某医院7株耐碳青霉烯类的K1型hvKP，其中有6株产KPC-2。2017年，Zhang等[35]收集了140株CRKP，发现21株hvKP且全部产KPC-2。研究[1]显示中国CRKP菌株中hvKP的流行率显著增高，为7.4%～15.0%，产KPC-2的hvKP中ST11型和ST23型的比率分别为50.0%、8.3%。这些结果意味着产生KPC-2的ST11型cKP和ST23型hvKP之间的移动遗传元件的交换已经发生。目前已经发现两种类型的接合：获得毒力基因或整个毒力质粒的cKP和获得染色体或质粒编码的抗菌药物耐药基因的hvKP。另外外膜蛋白缺失/表达下降或合并高产AmpC酶或ESBLs、外排泵的高度表达、生物膜的形成也是hvKP产生碳青霉烯类耐药的重要机制。

2.4 CRISPR_CAS系统 杜芳玲等[26]研究显示CRISPR_CAS系统阴性的菌株耐药率较CRISPR_CAS系统阳性的菌株高，其中耐药基因blaKPC、blaSHV、qnrS差异有统计学意义。应警惕的是CRISPR_CAS系统阴性菌株获得毒力质粒，成为高毒力、高耐药、高传播性，引起医院暴发感染的超级细菌。

3 结语

hvKP早期报道主要集中在亚洲，而如今hvKP已扩散至全球，应该认识到社区感染hvKP对健康个体的威胁。目前已发现rmpA/rmpA2、iuc、PEG-344可用作hvKP鉴定的生物学标志物，但hvKP还有很多致病机制尚未被发现，需要对hvKP毒性决定因素有一个全面的认识，以改进诊断并确定新的抗菌靶点。高耐药hvKP流行病学的明显变化，部分是现有高耐药ST11型cKP获得毒力质粒的结果。具有耐药基因和毒力增强的ST11菌株将具有更强的生存能力，并在医疗环境中引起感染。在无临床微生物学实验室对hvKP进行常规检测的情况下，确诊感染非常困难。因此，临床医生要意识到hvKP不仅在社区环境中引起感染，而且在医疗卫生环境中也能引起感染，而且对这种新型的MDR/XDR hvKP进行监测是至关重要的。