柞蚕微孢子虫检测方法概述*

刘 玲 杨晓瑜 程 明 郑 丹 柯皓天， 任建宇 李琼秀 杜国良

(1. 四川省丝绸工程技术研究中心，成都 610031；2. 四川省丝绸科学研究院有限公司，成都 610031；3. 四川省阆中蚕种场，四川 阆中 637400)

柞蚕微粒子病俗称锈病、黑渣病等，柞蚕微孢子虫(Nosemapernyi,Np)是引起柞蚕微粒子病的病原。Np孢子通过食下传染和胚种传染2种途径致病，其中胚种感染的危害最大，一旦发生会给柞蚕种繁育和柞蚕茧生产带来毁灭性经济损失，因此柞蚕微粒子病一直是柞蚕产业的重要检疫病害。尽早针对柞蚕微孢子虫进行快速、准确检测并阻断其传播，仍是生产上对柞蚕微粒子病的主要防控措施。本文简要介绍已有的检测柞蚕微孢子虫的4种方法，包括普通镜检法、常规PCR检测法、胶体金免疫层析检测法和荧光定量PCR检测法，供生产上对柞蚕微粒子病的早期检测诊断参考。

1 普通镜检法

自20世纪20年代开始，我国柞蚕业就在蚕种生产过程中对雌蛾抽样后利用显微镜鉴定其是否含有Np孢子，进而淘汰染病雌蛾产下的带毒卵，这项检测技术被称之为普通镜检法[1-2]。直到现在，在采用卵面、蚕具及蚕场环境消毒等综合防治措施中，普通镜检法仍然是控制柞蚕微粒子病暴发流行最有效的手段。

普通镜检法具有成本低、操作简单、方便实用的特点。四川省通江县柞蚕种场每年采用镜检法进行的柞蚕雌蛾磨蛾集团检验，能将带毒率控制在1‰以内，并且可达到“两降”(降低劳动强度和检验成本)、“两省”(节省检验时间，春季蚕种放养时间可提前5～6 d)、“三提高”(微孢子虫检出率提高、检出准确率提高、蚕种质量有效提高)的效果。

但是，普通镜检法对镜检人员的经验和专业技术水平要求较高，需要具备能准确识别柞蚕微孢子虫和辨识可交叉感染柞蚕的野外昆虫微孢子虫[3-4]的能力。

2 常规PCR检测法

邓真华等[5]利用常规PCR技术对柞蚕微孢子虫进行了有效检测。之前还有研究者采用稍加改进的斑迹抽提法[6]成功提取到柞蚕微孢子虫基因组DNA，采用的PCR扩增引物为P1/P2和N1/N2，这2对引物是依据已报道的微粒子属16S rRNA基因的保守序列[7-8]设计的。

实验结果表明，引物N1/N2的扩增灵敏度比引物P1/P2的高。在总体积为25 μL的PCR反应体系中，作为模板的柞蚕微孢子虫基因组DNA的含量为0.47 ng时，引物N1/N2仍能扩增出清晰的条带，表明常规PCR技术在检测柞蚕是否被柞蚕微孢子虫感染具有较高的灵敏度。

由于柞蚕微孢子虫具有一层几丁质外壳，一般化学物质很难去除，采用SDS法、CTAB法等常规DNA抽提法得到的微孢子虫基因组DNA在质量方面很难达到检测要求。采用斑迹抽提法[6]得到的DNA虽然能满足PCR扩增要求，但是提取步骤多、操作繁琐，增加了时间成本。此外，PCR仪设备昂贵，许多柞蚕种场的财力尚不能承受此支出。这些都是应用PCR技术检测柞蚕微孢子虫难以实用化的原因。

3 胶体金免疫层析检测法

王伯阳等[9]利用柞蚕微孢子虫孢子液直接免疫家兔获得柞蚕微孢子虫多克隆抗体后，采用以下2种方法制作了胶体金免疫层析试纸条。

双抗夹心法：将柞蚕微孢子虫多克隆抗体与25 nm的胶体金颗粒结合并固定在金标垫上，质控点C上的物质为羊抗兔二抗，检测点T上的物质为柞蚕微孢子虫多克隆抗体。

竞争法：将柞蚕微孢子虫多克隆抗体与17 nm的胶体金颗粒结合并固定在金标垫上，质控点C同双抗夹心法，柞蚕微孢子虫孢壁蛋白作为检测点T。

用2种试纸条同时检测不同浓度的柞蚕微孢子虫悬液，当悬液中的Np孢子浓度达到8×106mL-1时，检测10 min后，试纸条检测线显色趋于稳定。对比2种试纸条的检测结果，采用双抗夹心法制作的试纸条显色更清晰，因而结果更可靠，更具实用价值。

该方法具有结果直观、特异性强、可检测活体柞蚕微孢子虫等优点。但也存在2点不足：一是试验结果不稳定，灵敏度较常规PCR检测法低；二是试纸检测线显色清晰度较差，需要进一步优化试验条件。

4 荧光定量PCR检测法

米锐等[10]采用荧光定量PCR方法检测柞蚕微孢子虫的基因组DNA。实验依据标准曲线确定荧光定量PCR的Ct值≤35作为检测的敏感度区间，对柞蚕微孢子虫基因组DNA的最低检出限为0.004 6 ng，约为常规PCR技术检出限(0.470 0 ng)的100倍。

采用荧光定量PCR法、普通镜检法和常规PCR法检测相同的100粒柞蚕蛹样品，3种方法检测出的呈柞蚕微孢子虫感染阳性的样品数分别为54个、2个和34个。作者还利用该方法和普通镜检法抽样检测生产中的柞蚕种茧和雌蛾，结果显示，2种方法对柞蚕微孢子虫感染阳性检出率差异显著(P<0.05)。

荧光定量PCR是目前所有检测方法中灵敏度最高的。然而此方法检测结果的特异性和灵敏度依赖于被检测样本的高质量基因组DNA，采用斑迹抽提法[6]才能获得高质量的柞蚕微孢子虫基因组DNA，但这种提取方法的弊端如前面所述。

此外，荧光定量PCR仪价格昂贵，对操作人员的专业技术水平要求较高，一般柞蚕种场没有相应的设备和技术人员，限制了该方法的大范围应用。