三氧化二砷对人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231 教化单核细胞的影响

季秋兰，丁景弦（通信作者）

1 南昌大学第四附属医院老年科 （江西南昌 330003）；2 南昌市第三医院放疗科 （江西南昌 330025）

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，现阶段，其发病率仍呈持续升高的趋势。在欧美等发达国家，乳腺癌占女性恶性肿瘤的25%～30%[1]；与西方国家不同，我国乳腺癌的发病率呈双峰分布，第一高峰为40～45岁，相较于多发于妇女绝经后的西方国家提早了10～15年[2-3]。

肿瘤免疫治疗相关研究是当前研究的热点，有望通过激活机体自身免疫系统彻底清除肿瘤细胞[4]。然而，临床实践显示，肿瘤免疫治疗反应性差异很大，最主要的原因可能是患者肿瘤微环境中存在较强的免疫抑制状况，使浸润的T 淋巴细胞识别肿瘤细胞的能力下降[5]。肿瘤微环境中肿瘤相关的巨噬细胞（tumor associated macrophage, TAM）具有抑制肿瘤免疫的作用，其丰度是乳腺癌独立的不良预后因素[6]。

TAM 由单核细胞经替代途径活化、分化而来，通常具有M2型免疫表型，表达CD163。巨噬细胞集落刺激因子1（macrophage colony-stimulating factor 1，CSF1）是目前已知的参与单核细胞向M2型巨噬细胞活化、分化的细胞因子[7]。本课题组前期研究发现，激素受体阴性乳腺癌细胞株MDAMB-231 CSF1的表达水平明显高于激素受体阳性乳腺癌细胞株MCF-7。文献[8]报道，三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）能逆转三阴性MDA-MB-231的激素受体状态从而减弱其恶性生物学行为。本研究拟探讨As2O3对人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞教化单核细胞定向分化为M2型TAM的影响及其机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231原购自美国ATCC细胞库，U937细胞株由复旦大学马端教授馈赠，GFP-PURO双标稳定表达U937细胞系及RFP-NEO 双标稳定表达MDA-MB-231细胞系由本课题组前期建立。

1.1.2 药物和试剂

RPMI 1640细胞培养液、胰蛋白酶、青霉素、链霉素（Gibco 公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），As2O3（Sigma 公司），CSF1酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（Invitrogen），RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒及实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（日本TaKaLa 公司）。

1.1.3 仪器

CO2培养箱购自Thermo 公司，Transwell 板购自康宁公司，实时荧光定量PCR 仪购自Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将含5×104个MDA-MB-231细胞的完全培养基200 μl 接种于96孔板中，24 h 后吸出培养上清，向其中分别加入100 μl 无血清培养基或浓度分别为2、4、6、8、10、12 μmol/L 的As2O3培养液100 μl，每组3个复孔，继续培养24 h 后收集上清， 以200 g 离心5 min 除去细胞碎片，收集上清放于-80 ℃冰箱中保存待行ELISA 检测。

1.2.2 CSF1浓度检测

本实验利用Invitrogen 公司CSF1 ELISA 试剂盒检测不同培养上清中单核细胞分化相关细胞因子CSF1浓度，实验操作按照产品说明书操作流程进行。

1.2.3 MDA-MB-231细胞与U937细胞共培养

将5×105个U937细胞接种于Transwell 板（24孔，孔径5 μm）上室中，下室种不同处理组5×105个MDA-MB-231细胞，共培养24 h 后于荧光显微镜下观察空白对照组、不同浓度As2O3处理组MDA-MB-231细胞对U937细胞趋化运动的影响。

将不同实验组中5×105个MDA-MB-231细胞接种于Transwell 板（6孔，孔径0.4 μm）上室中，下室种5×105个U937细胞，共培养24 h 后检测空白对照组、不同浓度As2O3处理组MDA-MB-231细胞对U937细胞CD163基因表达的影响。

1.2.4 CD163的表达检测

针对共培养24 h 后的U937细胞与不同处理组MDAMB-231细胞，利用总RNA 提取试剂盒Trizol 按实验流程提取总RNA，利用TaKaLa 试剂盒反转录得到cDNA，利用逆转录实时荧光定量PCR 检测不同处理组U937细胞CD163表达的差异。GAPDH 作为内参基因，扩增片段引物系列见表1，PCR 反应条件参考既往发表文献[7]。

表1 引物系列及其产物片段长度

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 不同浓度As2O3处理对MDA-MB-231细胞表达CSF1的影响

0、2、4、6、8、10、12 μmol/L 的As2O3处理MDA-MB-231细胞24 h 后培养上清中CSF1的浓度分别为（266±28）、（242±28）、（204±12）、（127±10）、（94±13）、（82±22）、（54±17）ng/L，不同处理组间CSF1浓度比较，差异有统计学意义（F=54，P＜0.01），见图1。

图1 ELISA 检测As2O3 对MDA-MB-231 细胞培养上清中CSF1 浓度的影响

2.2 不同浓度As2O3处理MDA-MB-231细胞对共培养体系中U937细胞趋化的作用

0、6、12 μmol/L 的As2O3处理MDA-MB-231细胞24 h 后共培养体系中U937细胞迁移能力随着浓度递增而减弱，见图2。

图2 在共培养体系中不同浓度As2O3 处理MDA-MB-231 细胞对U937 单核细胞株趋化作用的差异

2.3 不同浓度As2O3处理MDA-MB-231细胞对共培养体系中U937细胞CD163表达的影响

0、2、4、6、8、10、12 μmol/L的As2O3处理MDA-MB-231细胞24 h后共培养体系中U937细胞CD163 mRNA的表达水平分别为100.0%、83.5%、73.8%、48.3%、36.5%、17.6%、8.7%，不同处理组间CD163 mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（F=120，P＜0.01），见图3。

3 讨论

三阴性乳腺癌约占女性乳腺癌的16%，目前尚未发现特定治疗靶点，总体预后较差。TAM 是肿瘤微环境中的重要细胞组成成分，主要通过促进新血管生成和瘤旁炎症反应等来发挥其在肿瘤生长、转移中的作用。研究发现，三阴性乳腺癌组织中TAM 丰度较高，体外实验也表明三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231诱导单核细胞株U937分化为TAM 的能力较强[6-7]。As2O3具有诱导分化作用，文献[8-9]报道其能诱导人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 ERα 启动子中的CpG 岛发生去甲基化，恢复表达雌激素受体。

图3 不同浓度As2O3处理MDA-MB-231细胞24 h 后对共培养体系中U937细胞表达CD163的差异

本研究通过Transwell 共培养系统，利用相关细胞生物学和分子生物学实验手段发现As2O3能下调CSF1的表达，从而减弱其教化单核细胞分化、活化为M2型巨噬细胞的能力。这为三阴性乳腺癌患者的治疗提供了新的实验依据，后续有望开展相关临床研究，进一步探讨As2O3治疗三阴性乳腺癌患者的安全性和有效性。