神经干细胞移植用于脑梗死的神经保护和再生治疗的研究进展

沈友进 戚晓昆 周宗华 何建文

1.广东省肇庆市德庆县人民医院神经内科，广东肇庆 526600；2.中国人民解放军总医院第六医学中心神经内科，北京 100048

脑卒中是一种古老的人类疾病，它严重影响了人们的生活[1]。脑卒中是导致人类长期残疾的主要原因，也是全球第二大死亡原因[2]。脑梗死是脑卒中的最主要类型。目前被循证医学证实有效的脑梗死急性期治疗方法只有静脉溶栓和机械取栓。然而，这两种方法只能用于急性期少数患者的治疗，且有时间窗限制。为了增加时间窗、减少副作用及提高预后，迫切需要寻找新的治疗脑梗死的方法。由于其具有神经保护、分泌生长因子及替代受损的神经细胞等多重治疗功能，神经干细胞移植治疗引起了人们极大的兴趣[2]。神经干细胞是神经系统中最原始未分化的细胞，可以产生中枢神经系统和周围神经系统中特异性的细胞。在一定的条件下，神经干细胞可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等，它具有自我更新能力。与传统药物治疗不同，神经干细胞可以对环境变化作出持续反应，分泌适当数量和类型的信号分子，故可以对不同的脑损伤作出相应的反应[3]。大量的动物实验及临床前试验均显示神经干细胞在脑梗死的治疗中具有巨大的潜力。因此，本文从神经干细胞来源、治疗脑梗死的机制、目前存在的问题等新进展方面进行综述。

1 神经干细胞来源

目前神经干细胞主要来源于胎儿脑组织、胚胎干细胞和诱导多能干细胞。自从Thomson 于1998 年从人类囊胚中建立了胚胎干细胞系以来，很多机构也陆续从人类、鼠类和其他灵长类的胚胎中成功分离、培养并建立了胚胎来源的可长期繁殖的神经干细胞系[2]。胚胎干细胞来源于囊胚的内部细胞群，可以产生能分化为任何体细胞类型的前体细胞。理论上，胚胎干细胞可以无限增殖，因而人们可以获得大量的神经干细胞来满足临床干细胞移植治疗的需要，这是比胎儿来源的神经干细胞更有优势的地方。但是，需要大量的操作才能使胚胎干细胞完全分化为神经干细胞。

胎儿来源的神经干细胞是进行神经干细胞移植治疗脑梗死的一种重要来源。胚胎来源的神经干细胞从受孕后7 至21 d 胎儿的脑皮质、中脑、脊髓组织中分离产生[4]。这些神经干细胞可以通过在含有碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的无血清培养基中生长传代[5]。

最近发现，通过转录因子的过表达，成年体细胞能够被重新编程逆分化为多能干细胞[6]。同胚胎干细胞类似，这些逆分化的多能干细胞具有可塑性和神经分化潜能[7]，被称作诱导多能干细胞。而相应的神经干细胞被称为诱导多能干细胞来源的神经干细胞。许多体细胞类型（包括容易从活组织检查中获得的成纤维细胞）都已经被重编程为诱导多能干细胞。因而，由于能够直接从患者自身的体细胞中获得，避免同种异体移植相关的免疫排斥风险，诱导多能干细胞来源的神经干细胞具有治疗神经系统疾病的巨大潜力。

2 神经干细胞的作用机制

神经干细胞移植可以通过多种机制治疗脑梗死。神经干细胞能够保护受损的神经细胞，促进内源性神经干细胞增殖与迁移，促进突触重塑，刺激新生血管形成，以及整合到主神经回路（同提高认知和感觉运动功能有关），从而恢复受损的神经功能，达到治疗脑梗死的目的[8]。然而，究竟是哪一种机制在有效恢复神经功能中起主要作用尚需进一步研究。

2.1 免疫调节

脑卒中后脑损伤是通过激活小神经胶质细胞产生强烈的免疫和炎症反应来传播的。激活的小神经胶质细胞释放细胞因子，上调内皮细胞上的单核细胞趋化蛋白-1 及细胞因子配体-1 等细胞因子的表达，通过血脑屏障促进外周单核细胞及巨噬细胞的浸润，从而加剧炎症损伤[9]。脑梗死患者进行神经干细胞移植，可以抑制炎症级联反应，提高患者的治疗效果[10]。新近研究表明，促炎因子S100A9 有助于克服急性炎症反应，提高神经干细胞移植治疗的效果[11]。

2.2 神经可塑性与神经重构

多年以来，人们认为成年脑细胞无再生潜能，脑损伤或患病后损伤的神经元不能再生。然而，近年来人们在成年哺乳动物脑内室管膜下区和海马齿状回发现有内源性神经干细胞存在[12]。脑卒中后室管膜下区和海马齿状回的神经发生明显增加，但这些再生的神经细胞仍然较少，不足以恢复损伤的神经组织功能。虽然有证据表明这些新生的神经细胞可以整合进内源神经系统中发挥功能，但是大约80%的新生神经母细胞和神经元在形成后2 周内死亡[13]。因而，增强内源性神经发生以代替丢失的神经细胞一直是脑卒中治疗的一个令人兴奋的治疗靶点[14]。

脑卒中后1 个月内患者表现出肢体功能、语言和认知功能方面不同程度的自发恢复。这种现象在很大程度上归因于神经回路的重新建立，在远离脑梗死区的其他脑区运动和感觉回路的活动得到增强。这种神经重构通过改变轴突、树突和突触的结构以及增强内源性神经干细胞的活性来调节。一些临床前动物模型已经证明，脑卒中后神经干细胞移植可以增强突触重构[15]。一项研究中，小鼠神经干细胞系移植到脑实质后，脑卒中患者脑中的突触发生标志物突触素和突触生长锥蛋白GAP-43 表达增加，其中部分是由移植细胞本身所表达的[16]。

神经干细胞移植促进血管生成，帮助脑卒中患者恢复功能。脑卒中后，局部内皮细胞和内源性神经干细胞之间的神经营养及再生因子进行交换，刺激血管生成。神经和血管部分进行交互反应，促进临床前期脑卒中模型和人类卒中患者的血管生成，改善脑卒中患者的神经功能[17]。总之，神经干细胞移植治疗脑梗死引起新血管形成，这是脑梗死后神经干细胞移植介导神经组织和功能恢复的一个主要机制。

2.3 神经细胞替代

通过脑梗死后神经干细胞移植，以健康个体脑中的神经细胞代替损伤坏死的神经细胞，是一个非常有吸引力的治疗方法。干细胞移植后，健康的神经干细胞植入受损区，分化成神经细胞和神经胶质细胞，重新建立突触联系[18]。研究证明，脑梗死损伤后脑中移植的神经干细胞最终分化为神经元，这些神经元表达NeuN、HuD、MAP-2 及β3 微管蛋白等神经元标志物[19-21]。然而，神经干细胞植入受损神经组织后，整合进内源性神经系统的神经细胞少、寿命短，需要反复多次移植，都是目前需要解决的问题。

3 存在的问题

目前，在神经干细胞移植被广泛应用于临床脑卒中治疗之前，仍有许多问题需要解决。在脑卒中环境中，血脑屏障受到损害，其通透性发生动态变化，导致全身免疫细胞的浸润。这就提出了脑卒中异体神经干细胞移植的免疫系统反应的问题。为克服免疫反应，同种诱导多能干细胞来源的神经干细胞更具有潜在优势。然而，如果需要大量的神经干细胞进行移植治疗，使用目前的技术生产诱导多能干细胞来源的神经干细胞，并进行安全测试，需要大量的时间。而这很可能超过了疾病治疗最佳效果的时间窗。目前还不清楚其他因素如卒中类型、卒中部位及严重性对神经干细胞移植成功的影响程度。另外，脑卒中患者常见的共患病（比如糖尿病和高血压病等）、年龄及性别因素对神经干细胞移植治疗脑卒中的影响尚没有或仅有有限的评估[22-23]。

尽管许多脑卒中神经干细胞移植治疗的临床前期研究取得了良好的效果，一些安全问题也必须得到妥善处理。一项研究中，研究者在小鼠大脑中动脉闭塞后24 h 将诱导多能干细胞移植到同侧纹状体，发现了移植细胞的肿瘤发生[24]。

为了使临床前期神经干细胞移植治疗脑卒中的成功进一步转化为临床试验，必需对移植途径、移植剂量和治疗时间窗等临床因素进行评价。

3.1 移植途径

神经干细胞移植治疗脑梗死有多种移植方式，如立体定向直接移植到脑实质、经穿刺移植到脑室或椎管中、经鼻腔途径，以及经静脉或动脉途径输入等。目前以立体定向经脑实质移植和经静脉途径移植最常见。在临床前期脑卒中动物模型中，立体定向经脑实质多点注射是最常用的移植方式。它有很多优点，如注射位点特异、直接移植的神经干细胞不通过血脑屏障，可以保证大量的神经干细胞到达损伤部位，限制治疗目标外的潜在影响（例如阻塞非靶器官的微血管导致缺血事件）。其最大障碍是需要高度侵袭性的颅骨切除术，这可能导致已经严重损伤的脑卒中患者出现额外的并发症。然而，另外两个临床试验测试了神经干细胞和成人干细胞经脑实质移植的安全性及有效性。结果表明，这种移植方式不良反应少，一般是安全的，患者耐受性好，值得进一步临床研究[3,25]。

另一种常用移植方式是经静脉途径输入。这种方式一般侵袭性小，不需较高的技术要求。在脑卒中急性期，患者病情尚不稳定而不能进行经脑实质神经干细胞移植治疗，这时经静脉输入神经干细胞治疗就成为可能。因此，医务人员可以在急救车去医院的路上给予神经干细胞静脉输入治疗。在一些神经外科技术欠发达的偏远农村地区也可以采用这种方式治疗。然而，经静脉输入移植由于细胞在非靶器官（如肺部和肝脏等）中聚集的倾向，导致脑中的移植细胞非常少[26]。静脉输入神经干细胞可以起到神经保护作用，提高神经功能，但没有脑卒中患者脑中移植细胞存活的依据。这表明抗炎和再生营养因子的释放是经静脉输入干细胞移植治疗策略的主要机制[27]。

经鼻腔移植是另外一种极具潜力的神经干细胞移植治疗脑卒中的方法[28]。经鼻腔移植操作相对简单，对患者损伤较小，神经干细胞可以绕过血脑屏障，极大地提高了进入脑内的神经干细胞数量。

神经干细胞移植的其他方式，如经穿刺移植到脑室或椎管中、经动脉途径输入等，目前使用相对较少，有些还处在探索阶段。总之，发展有效的、可应用于临床的脑卒中后神经干细胞治疗方式必须考虑到安全问题和临床疗效等问题。

3.2 治疗时间窗和剂量

在啮齿类动物模型中，人们对广泛的神经干细胞治疗时间窗进行了评估，时间窗范围从再灌注后立即移植至脑卒中后4 周。在这些临床前期研究中，治疗时间窗通常由预期的治疗作用模式决定。如果主要目的是最大化移植的神经干细胞的神经保护和免疫调节作用，移植常常选择在脑卒中急性期进行，这时脑梗死尚未完全形成，组织尚可以被挽救[29]。一项在慢性脑卒中患者中进行成人干细胞移植的临床试验中，这些慢性脑卒中患者在移植前神经功能评分稳定，移植后，通过成人干细胞介导的神经保护和再生机制，其平均评分显著改善[25]。这表明，脑卒中几个月后，神经组织重构仍可能处于活跃状态，干细胞治疗可以通过营养因子信号加强组织重构。相反，为达到细胞替代的目的，把细胞毒性较弱的亚急性期至慢性期作为时间点或许对干细胞移植更有利，可以提高移植细胞的长期存活率[30]。另一个值得临床进一步研究的技术考虑是最佳的神经干细胞移植剂量。在啮齿类动物研究中，脑实质移植的细胞剂量范围是1.0×105个至4.5×105个细胞，移植1 至3 个位点；静脉输入移植的细胞剂量范围是3.0×106个至4.0×106个细胞，一次性输入。没有证据表明移植方案之间存在结果差异。同时研究表明，移植更多的神经干细胞不会导致脑中出现更多的移植细胞，也不会增加神经细胞分化[30]。

3.3 局部微环境的影响

局部微环境在干细胞移植治疗脑梗死中起着非常关键的作用。为了研究脑梗死亚急性及慢性期干细胞移植后的微环境变化，研究人员将诱导多能干细胞及神经干细胞通过介入方式从大脑中动脉移植到脑梗死部位。干细胞移植后糖代谢明显升高，且神经功能评分明显提高。蛋白组学分析显示，共有39 个在亚急性和慢性期差异表达的蛋白质。这些蛋白质参与了包括神经元存活、轴突重塑、抗氧化应激和线粒体功能恢复等各种缺血性卒中相关的生物学过程[31]。一项研究中，研究人员通过局部低温的方式提供一种微环境来研究对干细胞的影响。结果表明，治疗性低温上调了Micro 1 蛋白的表达，增强了缺血性卒中干细胞移植后的神经保护作用[32]。近年来，人们发现输注干细胞分泌的胞外囊泡（也叫外泌体）是一种很有希望治疗脑卒中的方法。胞外囊泡通过细胞通讯、调节微环境等方式促进脑神经的恢复[33]。虽然人们对脑梗死干细胞移植时局部微环境的研究较多，但最佳的局部微环境尚未知。

4 小结

神经干细胞移植为脑梗死提供了一种很有前景的治疗方法。通过抗炎、促进内源性神经形成、促进血管新生、促进突触重构、细胞替代等作用机制，脑梗死后神经干细胞移植发挥神经保护作用，减少继发性损伤，继而促进神经组织及功能的恢复。虽然脑梗死后神经干细胞移植治疗在临床前期动物实验中取得了可喜的效果，但仍存在很多问题有待解决。未来我们应从增强脑梗死后神经干细胞移植治疗的效果、提高治疗安全性、减少不良反应、寻找最佳治疗时间窗等方面进行进一步研究。