间充质干细胞治疗急性呼吸窘迫综合征的机制研究进展

陈镜伊，梁志欣

解放军总医院第一医学中心 呼吸与危重症医学科，北京 100853

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是指各种致病因素导致肺部甚至全身过度的炎症反应激活，表现为肺上皮和血管内皮破坏，肺泡清除率下降，从而发生非心源性肺水肿[1]，是多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的重要组成部分，根据低氧血症程度(PaO2/FiO2)可将其分为轻、中、重度。病理研究发现，ARDS不仅可以表现为弥漫性肺泡损伤，还可能存在嗜酸性肺炎、急性纤维化、弥漫性肺泡出血等多种组织病理学改变[2]。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)最早由Friedenstein等[3]在骨髓中发现。MSCs作为一种异质细胞，早在2006年国际细胞治疗学会(ISCT)给予了其定义的最低标准：1)在标准培养条件下，MSCs必须保持塑料黏合性；2)MSC必须表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19、HLA-DR；3)MSCs必须在体外可分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。目前，可从骨髓、脐带血、脂肪等分离和制备间充质干细胞，以骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells，BMSCs)应用最为广泛。间充质干细胞具有强大的增殖能力、多向分化潜能和免疫调节功能，还具有来源方便、不存在免疫排斥等特征，且与胚胎干细胞相比，无道德伦理问题。可应用于造血干细胞移植、组织损伤修复、自身免疫疾病治疗以及充当基因治疗载体等。ARDS常见病因为败血症、肺炎和外伤等，可发展至多器官或组织的损伤。目前治疗方法主要为保护性机械通气，急性期内尚缺乏有效治疗措施，死亡率约40%，且随年龄增大死亡率有增加的趋势[4]。MSCs治疗ARDS的临床试验始于2014年，较早发布研究成果的有Wilson、Zheng等[5-6]团队，随后陆续开展MSCs用于治疗中度至重度ARDS的临床研究，目前已有Ⅰ期和Ⅱa期临床试验的相关报道[5,7]。为阐明MSCs治疗ARDS的可能机制，现就MSCs的归巢分化、分泌功能、炎性因子调节、巨噬细胞极化和基因修饰五个层面进行综述。

1 归巢与分化

MSCs的归巢特性是其治疗ARDS的关键环节之一。据相关研究，MSCs具有向受损部位迁移的特性，而正常组织并不会引发MSCs的聚集效应。外源性MSCs归巢至损伤肺组织可归纳为以下5个步骤：1)初始识别和滚动：MSCs借助其表面抗原CD44可紧贴内皮细胞表达的选择素，实现在血管壁上的滚动；2)活化：炎症信号引起趋化。此过程中，基质细胞衍生因子1作为趋化因子受体CXCR4的配体，对MSCs归巢至损伤肺组织具有至关重要的作用；3)捕捉：MSCs经趋化因子活化后，表面VLA-4整联蛋白与血管内皮细胞中VCAM-1相互结合；4)穿出：指MSCs像红细胞一样穿过内皮细胞和基底层，离开血液循环；5)迁移：经间质抵达受损肺组织[8]。

研究表明，BMSCs归巢后可分化为Ⅱ型肺泡上皮细胞，对损伤的肺泡-毛细血管屏障进行修复，从而减轻渗出，改善肺水肿。ARDS状态下，过量的中性粒细胞迁移导致肺上皮受损。Jiang等[9]将BMSCs与Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar typeⅡepithelial cell，ATⅡ)共培养后，发现BMSCs主要分化为ATⅡ细胞。此外，MSCs还可分泌多种生长因子，如角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)等。Zhu等[10]通过离体灌注人肺中建立的大肠埃希菌肺炎模型发现，MSCs促进单核细胞分泌KGF可能介导了肺泡液清除功能的恢复并促进肺上皮修复。体外研究发现，MSCs可通过分泌HGF来改善跨单层人肺微血管内皮细胞蛋白质的通透性，并修复肺内皮细胞的紧密连接和黏附连接[11]。Hu等[12]的研究构建了HGF基因敲除的MSCs，进一步发现MSCs需要通过HGF的表达来恢复肺血管通透性，上调VE-钙黏着蛋白表达，保护肺内皮细胞免于凋亡。

此外，MSCs可向受损伤的肺上皮细胞转移细胞质成分和线粒体以参与上皮修复。Sinclair等[13]将BEAS2B上皮细胞与标记的MSCs共培养，用分子抑制剂来确定隧道纳米管等结构的作用，发现从支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)分离的MSCs(BAL-MSCs)和人类肺组织分离的MSCs(LT-MSC)向BEAS2B上皮细胞进行细胞质和线粒体的转移，通过接触依赖性机制和非接触性依赖机制介导，且BAL-MSC和LTMSC的单向细胞质和线粒的转移效率相似。

2 自分泌与旁分泌

MSCs具有自分泌和旁分泌功能，可分泌多种生长因子和细胞因子参与归巢分化和免疫调控等过程。目前发现的MSCs分泌的可溶性因子有KGF、血管紧张素Ⅰ(angiotensin Ⅰ，Ang Ⅰ)、白细胞介素(interleukin，IL-1)受体拮抗剂、IL-10、前列腺素E2(prostaglandin E2，PEG2)、抗菌肽LL-37等。MSCs的旁分泌效应主要依靠细胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)来实现。EV可源于人体的各种细胞，包括微泡(microvesicle，MV)、外泌体和凋亡小体。EV可分泌多种生物活性物质，并参与细胞器转运，如蛋白质、mRNA、miRNA以及线粒体，主要功能为细胞间信息交流。MSCs来源微泡的LC-MS/MS分析已鉴定出730种蛋白，其对组织的修复再生潜力尚需深入研究。Lu等[14]在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(acute lung injury，ALI)模型中发现，MSCs通过旁分泌HGF激活HGF/Akt途径，诱导树突状细胞分化为耐受性树突状细胞，减轻肺水肿(肺湿重/干重比降低)，研究还发现该分化具有HGF依赖性，HGF基因高表达时效果较好，反之则较差。

鉴于MSCs的致瘤风险，现阶段认为干细胞源性条件培养基(conditioned medium，CM)和MSCs来源的EV是更理想的干细胞治疗替代品[15]。EV优点在于低致瘤性，低免疫原性。对MSCEV进行预处理可优化疗效，同时应选择合适的EV生长阶段[16-18]。同样的，MSC-EV对COVID-19的治疗效果也十分吸引人。外泌体(ExoFlo)是EV的重要来源之一，Sengupta等[19]已进行了BMSCs来源外泌体应用于COVID-19患者治疗的前瞻性非随机队列研究，不仅证实了其安全性和有效性，还发现ExoFlo很可能降低气管插管和机械通气的使用，有待进行完全随机对照试验进一步确认其疗效。

此外，MSCs分泌的抗菌肽、KGF等相关物质及其促进单核巨噬细胞的吞噬作用，可实现对病菌的清除。感染作为ARDS常见的始动因素，及时清除病菌在其治疗中显得尤为重要。研究发现抗菌肽hCAP-18/LL-37是MSCs发挥其抗菌作用的因素之一，KGF可通过AKT磷酸化来减少单核细胞凋亡，从而提高细菌清除率。此外，Jackson等[20]的研究在大肠埃希菌诱导的小鼠肺炎模型中发现，MSCs可通过隧道纳米管将线粒体转移至肺泡巨噬细胞，从而增强巨噬细胞吞噬细菌的能力。

3 炎性因子调节

炎性因子风暴在ALI/AR DS的进展中起着重要的作用。ARDS有两种亚型：高炎症亚型和低炎症亚型[21]。与低炎症亚型相比，高炎症亚型的ARDS特点在于血浆炎症标志物明显升高、升压药使用率高、败血症发生率高和血清碳酸氢盐浓度低[22]。研究发现MSCs可降低促炎因子，如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、γ干扰 素(interferon-γ，IFN-γ)、IL-1α、IL-1β、IL-6等，同时提高抗炎因子水平，如IL-4、IL-5、IL-10等。特别的是，在不同的研究中发现MSCs对某些因子的分泌水平的调节并不一致[23]。Cóndor等[24]发现MSCs可提高IL-10水平，而Sepúlveda等[25]发现MSCs有降低IL-10的作用。这种不一致性在其对IFN-γ的调节上亦有体现，MSCs既可增加IFN-γ分泌，又可减少IFN-γ分泌[26]。还有研究结果发现MSCs对IFN-γ水平并无明显影响。

Walter等[27]及其团队已证实BMSCs的亚群可分泌IL-1Ra、肿瘤坏死因子诱导蛋白6(tumor necrosis factor alpha stimulated gene-6，TSG-6)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)，IL-1Ra可以抑制辅助T细胞分泌的细胞因子和巨噬细胞产生的TNF-α；在LPS诱导的ALI模型中，BALF中可见高表达的TSG-6，细胞因子和炎症细胞水平较低，并且敲除人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)中的TSG-6 mRNA可降低(hMSCs的抗炎作用。IGF-1可使肺泡巨噬细胞向M2抗炎表型分化。此外，PGE2是一种强效的免疫调节因子。有研究表明，当血液中PGE2浓度升高时，肺中的巨噬细胞向M2极化增多。

4 巨噬细胞极化

肺泡巨噬细胞是呼吸道的第一道免疫防线，在炎症发展过程中具有不可忽视的作用。巨噬细胞的极化分为M1型和M2型两种。M1型为促炎型，主要在急性炎症期极化，此时高表达一氧化氮合酶和CD86，可以由LPS和IFN-1诱导，能产生促炎因子如TNF-α、IL-1β等。M2型为抗炎高吞噬型，CD206是其表面标志物，可以由IL-4诱导。与MSCs共培养的巨噬细胞CD206表达增加，该条件下的巨噬细胞具有以下典型特征：表达高水平IL-10和低水平IL-12。此外还表达IL-6和TNF-α，并且呈现出高吞噬性。另一项研究发现，在ARDS中，MSCs通过EV介导的线粒体转移也可使肺泡巨噬细胞向M2型分化。MSCs主要通过增强巨噬细胞的氧化磷酸化诱导巨噬细胞表型转化，抑制炎性因子分泌，在肺组织的损伤和修复中具有重要作用[28]。

除巨噬细胞外，中性粒细胞也是ALI/ARDS的主要效应细胞之一。免疫反应中，中性粒细胞除了具有吞噬和分泌功能外，还会形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)，更有效地捕获病原体。然而NETs的过度增加会引起组织损伤，如在ARDS中，NETs可促进巨噬细胞向M2型极化，放大炎症反应[29]。Pedrazza等[30]研究发现MSCs在LPS诱导的ALI动物实验模型中不仅具有抗炎、抗组织损伤等作用，还可减少NETs的形成，有效提高了存活率。

5 基因修饰

向MSCs中导入外源基因并整合，最有效的方法是病毒转导，以慢病毒转导较为多见，非病毒转导因技术不成熟等缺陷而受限。基因修饰旨在改善MSCs归巢和抗凋亡、更有效地控制炎症、修复上皮，从而减轻肺水肿。如血红素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)具有抗炎，抗氧化和抗凋亡等作用。Chen等[31]经慢病毒转导建立的MSC-HO-1对LPS诱导的小鼠ALI模型具有更好的治疗效果，研究发现MSC-HO-1在体外实验中具有抗凋亡、增强MSCs的旁分泌和减轻肺水肿的特性。

MSCs的归巢能力是肯定的，不足在于MSCs归巢范围并不十分精准，低归巢率使其疗效大打折扣。进行基因修饰后的MSCs归巢能力得到很大程度改善，且已成为研究热点。Yang等[32]发现趋化因子受体CXCR4具有改善MSCs归巢和旁分泌的作用，故过表达CXCR4的MSCs对ARDS的治疗潜力有所提高。Meng等[33]敲除MSCs的LincRNA-p21和缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)抑制剂KC7F2后评估MSCs的迁移、增殖、凋亡及HIF-1α和CXCR4/7蛋白，发现低氧预处理可增加LincRNA-p21和HIF-1α表达，并通过激活CXCR4/7途径改善MSCs迁移和存活，但该研究的局限在于24 h内的体外研究。

炎症的控制对于ALI/ARDS的治疗及预后尤为重要，增强MSCs的抗炎作用将增益MSCs的治疗效果。IL-33/IL-1受体样1(ST2)轴在肺部免疫炎症反应的发展中起关键作用。基因修饰后的高表达sST2的人脂肪来源干细胞能更好地控制ALI/ARDS的炎症反应。MSCs分泌的KGF是最强大的细胞因子之一，通过促进Ⅱ型肺泡细胞增殖和刺激表面活性剂合成参与水肿清除和肺上皮愈合过程。在LPS诱导的ALI鼠模型中，通过量化BALF中的总蛋白可发现过表达KGF的MSCs使肺水肿明显减少。血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)过表达的MSC-ACE2用于LPS诱导的ALI可保护内皮，减轻炎症和病理损伤[34]。Hippo信号下调可促使mMSCs分化为Ⅱ型肺泡上皮细胞，从而修复受损组织，改善肺上皮的通透性和肺水肿，此外Li等[35]在LPS诱导的ARDS动物模型中，通过Last1基因敲除，下调Hippo信号通路可减轻炎症、改善病理损伤和纤维化。但由于ARDS在遗传学无明显异质性等问题，仍需进一步研究。新的研究发现过表达p130或E2F4的mMSCs向肺上皮细胞分化增多，从而修复ARDS肺部组织的损伤并恢复功能[36]。

6 结语

MSCs凭借其组织修复和免疫调节等独特的生物学特性，为ALI/ARD的治疗开辟了新的思路。如在COVID-19的治疗中，脐带血来源的间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)被认为是最为理想的干细胞类型[37]，且UC-MSCs用于治疗COVID-19已通过Ⅰ期临床试验，对于中重度患者的早期治疗，静脉输注UC-MSCs安全性和耐受性良好，但重症患者的长期预后有待Ⅱ、Ⅲ期随机安慰剂对照疗效试验完善[38]。MSCs用于COVID-19的治疗虽尚处于临床试验阶段，但其用于治疗ARDS已成为新策略并纳入了临床应用。然而MSCs的安全性和有效性并不完全肯定，近年来不少研究已把重点放在改善其归巢率、成活率等亟须解决的问题上[39]。再生医学应用于ARDS的治疗有着广阔的前景。