麻芩消咳颗粒平喘抗炎作用研究

潘怡惟，邓雪阳，马世平，傅强

(中国药科大学中药学院，江苏 南京 211198)

哮喘，又称支气管哮喘，是一种异质性疾病。哮喘常以慢性气道炎症为特征，并与气道高反应性相关，导致反复发作的喘息、气急、胸闷、咳嗽。特别是在夜间或清晨发作或加剧，这些发作通常与肺内气流阻塞相关，通常可以自发地或通过治疗逆转[1]。以哮喘为代表的慢性呼吸系统疾病具有发病率高，病程长，治疗费用高等特点[2]。对患者、家庭、社会带来沉重负担。临床对于哮喘的治疗，主要使用的西药有：糖皮质激素、茶碱类、抗IgE抗体、白三烯调节剂等药物[1,3]。

麻芩消咳颗粒来源于安徽省老中医的临床经验方，以“麻杏石甘汤” 为基础加减而得，由麻黄(密炙)、桑白皮、金银花、黄芩等多种中药组成，具有清肺化痰、止咳平喘的功效。临床上常用于痰热所致之咳嗽、喘息、痰黄稠厚等症。为验证麻芩消咳颗粒对大鼠哮喘模型的药效作用，本研究建立了卵蛋白致敏的大鼠哮喘模型，探究麻芩消咳颗粒的平喘抗炎作用及其机制，为该产品临床扩大适用症提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠，体重180～200 g，购自浙江省医学科学院实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK(浙)2019-0002。动物使用许可证号：SYXK(苏)2018-0019。自由摄食和饮水，室温(25±2)℃，相对湿度50%～60%，昼夜12 h交替。适应性喂养一周后用于实验。

1.2 药物及试剂 麻芩消咳颗粒(亿帆制药，国药准字：Z20040092，批号：190602)；肺宁颗粒(修正药业集团股份有限公司，批号：180365)；卵蛋白(Sigma公司，货号：A5253)；大鼠 IL-6 ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：E-EL-R0015c)；大鼠 IL-17 ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：E-EL-R0566c)；大鼠IgE ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：E-EL-R0517c)；大鼠 IL-4 ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：E-EL-R0014c)；PI3K一抗(Cell Signaling Technology，批号：4255)；P-PI3K一抗(Affinity Biosciences，批号：AF3241)；AKT一抗(Cell Signaling Technology，批号：4691)；P-AKT一抗(Cell Signaling Technology，批号：4060)；兔二抗(Bioworld公司，批号：AA01201)。

1.3 仪器 超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司，型号：402B)；-80 ℃超低温冰箱(美国Thermo公司)；SN3001全波长多功能酶标仪(美国Thermo公司)；全自动数码凝胶/化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司)；EPS 600电泳仪(上海天能科技有限公司)。

1.4 动物分组给药 大鼠根据体重随机分为6组，分别为肺宁颗粒2.5 g·kg-1组、麻芩消咳颗粒1、2、4 g·kg-1组、模型组和溶剂对照组。

1.5 模型制备 分别于第0、7天，模型组及各给药组大鼠皮下多点注射卵蛋白混悬液致敏。空白组皮下注射等体积生理盐水作为对照。第15天开始，模型组及各给药组用1%的OVA生理盐水溶液雾化激发哮喘。从激发第一天开始给药，共计给药4周，空白和模型组给予等体积生理盐水。末次激发后处死大鼠，收集组织样本，于-80 ℃冰箱保存。

1.6 指标检测

1.6.1 ELISA测定肺泡灌洗液中炎症因子 每组取8只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，分离颈部肌肉进行气管插管，用PBS盥洗肺组织，共盥洗3次。合并肺泡盥洗液(BALF)，取盥洗液1 mL，3 000 r·min-1离心5 min，取上清。按ELISA试剂盒说明书，测定其中IL-6、IL-17含量。

1.6.2 ELISA测定血清中IgE、IL-4含量 每组取8只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，经腹主动脉采血。静置30 min后，3 000 r·min-1离心15 min，取上清。按ELISA试剂盒说明书操作，测定其中IgE、IL-4含量。

1.6.3 肺组织的病理学观察-HE染色 固定大鼠肺组织，制作石蜡切片，进行HE染色。显微镜下观察肺组织病理学变化，观察肺泡上皮细胞的损伤程度以及气管壁增厚程度。

1.6.4 Western blot检测相关蛋白表达 收集大鼠肺组织，-80 ℃保存。 肺组织按重量体积比(1∶50)加入含有1% PMSF的RIPA Buffer。于冰上研磨匀浆，裂解30 min。 4 ℃，12 000 r·min-1，离心30 min。吸上清加入体积为1/4的5× SDS-PAGE Loading Buffer 混匀，煮沸10 min。于-20 ℃冰箱保存，Western blot检测肺组织中PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT的表达水平。

2 结果

2.1 麻芩消咳颗粒对过敏性哮喘大鼠肺泡灌洗液中炎症因子表达的影响 与空白组相比，模型组大鼠BALF中IL-6、IL-17显著升高(P<0.01)。与模型组相比，肺宁颗粒组能够降低IL-6水平，但不具有显著性差异，显著降低IL-17水平(P<0.05)。麻芩消咳颗粒低、中、高剂量组能降低BALF中IL-6、IL-17水平(P<0.05、P<0.01)。麻芩消咳颗粒各剂量组与肺宁颗粒组之间无统计学差异(P>0.05)，结果见表1。

表1 麻芩消咳颗粒对大鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-17含量的影响

2.2 麻芩消咳颗粒对过敏性哮喘大鼠血清中IgE、IL-4含量的影响 与空白组相比，模型组大鼠血清中IgE、IL-4显著升高(P<0.01、P<0.05)。与模型组相比，肺宁颗粒组能够显著降低IgE、IL-4水平(P<0.01、P<0.05)。麻芩消咳颗粒中、高剂量组能够显著降低血清中IgE、IL-4水平(P<0.01、P<0.05)。麻芩消咳颗粒各剂量组与肺宁颗粒组之间不具有统计学差异(P>0.05)，结果见表2。

表2 麻芩消咳颗粒对大鼠血清中IgE、IL-4含量的影响

2.3 肺组织的病理学观察-苏木精-伊红染色 空白组大鼠肺组织支气管壁、肺泡结构完整且清晰，未见明显炎性浸润现象。相比于空白组，模型组大鼠支气管壁明显增厚，可见大量炎细胞浸润，肺泡结构破坏。肺宁颗粒给药干预后，相比于模型支气管壁厚度降低，炎性细胞数量降低。麻芩消咳颗粒低、中、高均能明显改善卵蛋白诱导的大鼠肺部组织支气管壁增厚，炎性浸润现象，结果见图1。

2.4 对肺组织PI3K/AKT信号通路蛋白表达的影响 模型组大鼠肺部组织p-PI3K/ PI3K水平相比于空白组大鼠显著升高(P<0.01)，肺宁颗粒及麻芩消咳颗粒中剂量给药后，可显著降低p-PI3K/PI3K水平(P<0.05、P<0.01)。麻芩消咳颗粒各剂量组与肺宁颗粒组无统计学差异(P>0.05)，结果见图2。

图1 肺组织HE染色(×200,n=3)

图2 麻芩消咳颗粒对大鼠肺组织中p-PI3K/ PI3K表达水平的影响(n=3)注：与空白组相比，## P<0.01；与模型组相比，*P<0.05,**P<0.01

模型组大鼠肺部组织p-AKT/AKT水平相比于空白组大鼠显著升高(P<0.01)，肺宁颗粒及麻芩消咳颗粒中剂量给药后，可显著降低p-AKT/AKT水平(P<0.05、P<0.01)。麻芩消咳颗粒各剂量组与肺宁颗粒组无统计学差异(P>0.05)，结果见图3。

图3 麻芩消咳颗粒对大鼠肺组织中p-AKT/AKT表达水平的影响(n=3) 注：与空白组相比，##P<0.01；与模型组相比，*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

哮喘发病率逐年升高，其发病因素、机制复杂。发病因素包括遗传因素，环境因素如病毒、细菌、粉尘、药物、花粉、食物、寒冷、劳累等[4]。哮喘其发病与多种因素相关，目前机制尚不明确[5-6]。由此，防治哮喘药物的开发显得尤为重要。

炎症在许多呼吸系统疾病的发病中起着关键作用，例如哮喘、急性肺损伤和慢性阻塞性肺疾病等[7-8]。其中，气道免疫-炎症机制认为由Th2细胞活化并产生的细胞因子IL-4，在哮喘发生过程中起到关键作用。IL-4对IgE的产生、诱导肥大细胞具有影响。IgE可结合嗜酸性粒细胞和肥大细胞，与其表面的高亲和力IgE受体结合，形成致敏状态[9-11]。当机体再次接触到过敏原，肥大细胞内会发生一系列的信号转导，发生脱颗粒并释放大量炎性介质，导致气道平滑肌痉挛，发生过敏性哮喘的临床症状。本研究结果发现，对比空白组大鼠，哮喘模型组大鼠 血清中IL-4、IgE含量显著升高。相比于模型组大鼠，麻芩消咳颗粒可以显著降低血清中IL-4、IgE水平，并能显著降低BALF中IL-6、IL-17水平。提示麻芩消咳颗粒的平喘作用可能与其降低IL-4、IgE、IL-6、IL-17水平，抑制气道免疫-炎症反应有关。

磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路在炎症和肿瘤等病理状态的产生、发展过程中均具有重要的影响作用[12]。其能够通过多种渠道对炎症的发生起到调控的作用，从而影响炎症的发生和发展，并且参与到细胞的生长、增殖、分化调节的信号转导通路[13-14]。本研究结果发现，模型组大鼠存在PI3K/AKT通路的异常激活，相比于模型组大鼠，麻芩消咳颗粒能够显著降低大鼠肺部PI3K及AKT磷酸化水平。提示麻芩消咳颗粒平喘抗炎的分子机制可能有其调节PI3K/AKT信号通路有关。

综上所述，本研究证实麻芩消咳颗粒对OVA诱导的过敏性哮喘大鼠具有显著的平喘抗炎作用，能够改善OVA诱导的大鼠肺部组织损伤，气管腔狭小，炎性浸润。其作用机制可能与PI3K/AKT信号有关，为麻芩消咳颗粒临床应用拓展提供依据。本研究初步探究了麻芩消咳颗粒药效及潜在机制。但哮喘发病机制复杂，后续仍需进一步的机制探究。